ELL2基因多態性與涎腺多形性腺瘤易感性的相關性分析

楊思遙，王媛媛，劉建兵，劉志榮*

1山西白求恩醫院/山西醫學科學院同濟山西醫院/山西醫科大學第三醫院口腔科，山西太原 030032；2山西醫科大學基礎醫學院，山西太原 030001

涎腺多形性腺瘤是常見的涎腺腫瘤之一，具有多向分化的特點，異質性高，部分涎腺多形性腺瘤可發生惡性轉化[1-2]。涎腺多形性腺瘤發生多向分化和惡性轉化的機制尚不清楚，環境因素(如電離輻射)、吸煙、飲酒和激素水平與該病的發生有關，但該病的分子遺傳學變化目前尚不清楚。研究發現，涎腺多形性腺瘤相關基因常有重排和拷貝數變異，涉及轉錄因子多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1)和高遷移率族AT Hook 蛋白2(highmobility group AT-hook 2，HMGA2)[3-4]。1997 年，Shilatifard 等[5]發現，轉錄因子家族的新成員——RNA 聚 合 酶2 延 伸 因 子(elongation factor for RNA polymerase Ⅱ 2，ELL2)基因位于5q15，有12 個外顯子。ELL2 在漿細胞分泌免疫球蛋白中起核心作用，能有效地指導mRNA 的剪接加工，調節其轉錄活性[6-7]。ELL2可調節細胞的生長和增殖，在人類惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用[8-9]。有研究發現，ELL2是多發性骨髓瘤的易感基因且rs3888189-C等位基因與涎腺癌的發生有關[10]；ELL2 是雄激素受體(AR)陰性前列腺癌細胞生存和增殖所需的潛在致癌蛋白[11]。本研究對腮腺多形性腺瘤家系5 個成員的ELL2 基因外顯子進行了擴增和測序，并招募了112例涎腺多形性腺瘤患者及176 名健康對照者檢測其ELL2 基因1119T＞C 多態性，旨在闡明1119T＞C 多態性與涎腺多形性腺瘤發生的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 將2015年11月山西白求恩醫院收治的1 例55 歲男性腮腺多形性腺瘤患者作為先證者，收集該患者的親屬信息。采用病例對照研究，納入2016年1月-2020年7月在山西白求恩醫院口腔頜面外科就診的112 例涎腺多形性腺瘤患者(病例組)及2019年1月-2020年1月本院的176名健康體檢者(對照組)進行驗證分析。納入標準：(1)按Seifert等[12]的方法，術后經組織病理檢查確診為涎腺多形性腺瘤；(2)臨床資料完整；(3)進行門診或電話隨訪；(4)簽署知情同意書。排除標準：合并其他腫瘤或嚴重心、肺、腎功能障礙。本研究獲山西白求恩醫院倫理委員會審批(審批號：YXLL-2022-046)。

1.2 主要試劑及儀器 全血基因組DNA提取試劑盒購 自 美 國Omega Bio-Tek 公 司，RNA 提 取 試 劑RNAiso、2×PCR Premix Taq酶購自日本TaKaRa公司，LC-Green 飽和熒光染料購自美國Idaho Technology 公司。高分辨熔解曲線分析儀LightScannerTMInstrument 96 購自美國Idaho Technology 公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 資料收集 收集腮腺多形性腺瘤患者及其親屬信息，繪制系譜圖；收集病例組和對照組的一般資料，包括性別、年齡、吸煙情況、腺瘤病理組織分型等，其中吸煙情況通過問卷調查方式獲得，參考Franco 等[13]吸煙情況以香煙總數計算，曾經吸煙定義為每天吸煙≥1 包、持續1 年以上；不吸煙被定義為從不吸煙，或者每天吸煙≥1 包、持續1 年以上，但戒煙超過6個月。

1.4 全血基因組DNA 提取及單核苷酸多態性(SNP)分型 采集家系成員Ⅱ4、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ11、Ⅲ12，以及112例涎腺多形性腺瘤患者和176名健康對照的外周血約2 ml，采用全血基因組DNA 提取試劑盒提取全血DNA。使用Primer Premier 5 軟件設計引物，用于擴增ELL2 外顯子8 及測序的引物見表1。采用高分辨熔解曲線(high resolution melting，HRM)對ELL2 1119T＞C 進行分型。PCR 體系包含：基因組DNA 0.1 μg，上 下 游 引 物 各0.1 μl(10 pmol/μl)，2×PCR Premix Taq酶5 μl，高低溫內標0.1 μl，LC-Green飽和熒 光 染 料1.0 μl，蒸 餾 水 加 至10 μl。擴 增 條 件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸6 s，共35 個循環；72 ℃延伸7 min；95 ℃變 性30 s，24 ℃退 火4 min。PCR 擴 增 產 物 使 用LightScanner? Instrument 96自動進行基因分型。每個基因型隨機抽取5 個樣本，采用測序引物進行PCR擴增，擴增產物送生工生物(中國上海)進行測序，確定HRM基因分型結果。

1.5 實時定量RT-PCR 檢測不同基因型個體ELL2表達水平 為明確1119T＞C 位點不同基因型個體是否影響ELL2 基因的表達，使用RNAiso 試劑從患者外周血中提取總RNA，取1 μg RNA反轉錄，采用實時定量PCR (quantitative real-time PCR)檢測ELL2基因的表達水平，以GAPDH 為參照，引物序列見表1。對每個樣品重復3次，并測定平均Ct值，以2-ΔΔCt表示ELL2的相對表達量。

表1 PCR引物序列
Tab.1 Primer sequences for PCR

1.6 指標分析 分析病例組與對照組年齡、性別和是否吸煙的差異，以及吸煙與涎腺多形性腺瘤發病風險的關系。根據病例組與對照組的基因型頻率：(1)進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，并檢驗ELL2 1119T＞C 各基因型與涎腺多形性腺瘤的相關性及其在涎腺多形性腺瘤不同組織分型中的分布；(2)計算兩組中吸煙與不吸煙者的等位基因C 和T 的基因頻率，并將是否吸煙作為分層因素，分析ELL2 T1119C 等位基因與吸煙是否存在協同作用；(3)比較不同基因型個體外周血ELL2 mRNA 表達水平的差異。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計數資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料呈正態分布時以±s 表示，組間比較采用t檢驗，呈非正態分布時組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 涎腺多形性腺瘤患者家系情況 涎腺多形性腺瘤患者的家系譜如圖1 所示，55 歲患者Ⅱ7為先證者，該家族中有5 例患者。其中，Ⅱ5為黏液表皮樣癌，其他患者為唾液腺良性腺瘤。家系中5 位成員(Ⅱ4、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ11、Ⅲ12)進行了外顯子8 擴增和測序。

圖1 一例涎腺多形性腺瘤家系Fig.1 A pedigree of pleomorphic adenoma of the salivary gland

2.2 兩組一般特征比較 病例組與對照組性別、年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)，但病例組的吸煙比例高于對照組(P=0.013)(表2)，吸煙可增加涎腺多形性腺瘤的發病風險(OR=1.828，95%CI 1.131～2.956)。

表2 涎腺多形性腺瘤患者與對照組的一般特征比較[例(%)]Tab.2 Comparison of general characters between patients with pleomorphic adenoma of salivary gland and control group [n(%)]

2.3 ELL2 1119T＞C多態性與涎腺多形性腺瘤發生的相關性 對該家族5 個成員ELL2 外顯子的測序結果顯示，除第8 外顯子在不同個體中具有TT、CT 和CC基因型外，其余序列一致(圖2A)。1119T＞C位點可能是一個SNP位點。隨后在112例患者和176名健康對照者中擴增了第8 外顯子T1119C 位點，采用HRM法對該位點進行自動基因分型，每個基因型隨機抽取5 個樣本進行測序，結果顯示HRM 法對于TT、CT 或CC 基因型分型與測序結果一致(圖2B、C)。通過Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，對照組為遺傳平衡群體(P＞0.05)；對照組最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)=0.36；基因型頻率分析結果顯示，涎腺多形性腺瘤患者中純合子CC的比例明顯高于對照組(P=0.002)；純合子CC與涎腺多形性腺瘤發生風險增加相關(OR=3.059，95%CI 1.494～6.263，表3)。

表3 涎腺多形性腺瘤患者與對照組的ELL2 T1119C 基因型頻率[例(%)]Tab.3 The genotype frequencies of ELL2 T1119C in patients with pleomorphic adenoma of salivary gland and control group[n(%)]

2.4 ELL2 1119T＞C多態性在涎腺多形性腺瘤不同病理類型中的分布 對112 例涎腺多形性腺瘤患者的病理類型進行分析，并比較T1119C等位基因及基因型在不同病理類型中的分布情況，結果顯示不同病理類型間T1119C等位基因及基因型差異無統計學意義(P＞0.05，表4)。

表4 ELL2 T1119C等位基因及基因型在不同病理類型中的分布Tab.4 Distribution of ELL2 T1119C alleles and genotypes in different pathologic types

2.5 ELL2 1119C多態性與多形性腺瘤相關性強度的分層分析 分層分析結果顯示，吸煙與C 等位基因協同作用可增加涎腺多形性腺瘤的發病風險(OR=2.180，95%CI 1.361～3.491，P=0.001，表5)。

表5 ELL2 T1119C 多態性與多形性腺瘤相關性強度的分層分析Tab.5 Stratification analysis of the strength of the association between ELL2 T1119C polymorphism and pleomorphic adenoma

2.6 T1119C 不同基因型個體外周血ELL2 的表達水平 實時定量RT-PCR 法檢測結果顯示，CC 基因型ELL2 mRNA 表達水平明顯高于CT(P=0.035)或TT(P=0.003)基因型個體(圖3)。

圖3 不同基因型ELL2 mRNA的表達水平Fig.3 Expression levels of ELL2 mRNA in different genotypes

3 討 論

涎腺多形性腺瘤缺乏特異性的分子標志物，其多向分化及惡性轉化的機制尚不明確。本研究對一個涎腺多形性腺瘤家族的5 個成員ELL2 外顯子進行測序后發現，第8外顯子中存在一個新的SNP位點：1119T＞C，該位點可使ELL2 基因第373 位密碼子由CCT 變為CCC(p.Pro373Pro)，為同義突變。5 例家族成員中有3 例為CC 基因型，1 例患者和1 例健康成員在該位點為CT 基因型。因此，本研究招募了112例涎腺多形性腺瘤患者和176名健康對照者，利用HRM法分析該位點多態性，并進行基因分型。結果顯示，該位點的MAF 為0.36，屬于SNP 位點。ELL2的1119-C等位基因與涎腺多形性腺瘤相關，吸煙與C 等位基因協同作用可增加涎腺多形性腺瘤的發病風險。HRM結果未顯示該位點的不同基因型與涎腺多形性腺瘤的不同病理類型有關。

外顯子中的一些同義突變也稱為沉默突變。雖然，本研究ELL2中的1119T＞C為同義突變，但患者中CC 基因型的頻率明顯高于對照組，提示ELL2 1119 T＞C 位點不同基因型可影響ELL2 基因的表達。一般來說，外顯子發生同義突變會導致選擇性剪接或翻譯效率的改變，從而影響基因的表達水平。Ando 等[14]報道了mabA(g609a)的沉默突變將突變附近 的 區 域 轉 化 為 抑 制 素α 亞 單 位(inhibin subunit alpha，inhA)基因的一個替代啟動子，導致異煙肼(isoniazide，INH)的inhA 靶基因表達上調，mabA(g609a)沉默突變是INH 耐藥的一種新機制。外顯子的沉默突變也可能導致外顯子跳躍，Joshi 等[15]報道了一例45 歲的肌肉萎縮患者，在ANO5 中含有沉默突變Leu115Leu(c.345G＞A)；這種突變導致了選擇性剪接，cDNA分析顯示存在6號外顯子跳躍，與肌營養不良發生相關。Ogasawara等[16]也報道了Rh血型D抗原(Rh blood group D antigen，RHD)基因發生960 G＞A同義突變，因而影響了基因的可變剪接，降低了D抗原的表達和外顯子7的保留。

ELL2促進編碼免疫球蛋白重鏈復合體(IgH)基因的多聚腺苷酸化和外顯子跳躍。研究發現，低ELL2表達導致分泌型特異性免疫球蛋白重鏈mRNA 表達豐度降低。ELL2 蛋白通過刺激IgH 基因啟動子近端poly(A)位點偏好和外顯子跳躍，從而促進分泌型IgH mRNA 的轉錄后加工。因此，ELL2 通過增強非一致剪接位點的外顯子跳躍和促進弱啟動子近端poly(A)位點的使用，從而獨特地影響IgH 前mRNA的加工[17]，并在某些腫瘤中促進細胞惡性轉化[18]。對良性唾液腺腫瘤的蛋白質組學研究發現，IgH 與細胞凋亡、細胞增殖相關蛋白的過度表達有關[19]，分泌型免疫球蛋白重鏈表達譜對于闡明涎腺多形性腺瘤向惡性腫瘤轉變的機制具有重要意義。大量研究發現，漿細胞分布、免疫球蛋白表達及免疫應答在涎腺多形性腺瘤的發生及惡性轉化中發揮重要作用[20-21]。此外，腫瘤源性IgG的高表達與惡性腫瘤的發生發展呈正相關[22]。Swaminathan等[23]發現，ELL2的Thr298Ala錯義變體可增加多發性骨髓瘤的發生風險；Wang 等[11]發現，ELL2 的缺失突變可誘導小鼠前列腺上皮內瘤變；在AR 陰性前列腺癌細胞中ELL2 可促進前列腺癌細胞增殖，是AR 陰性前列腺癌細胞生存和增殖所需的潛在致癌蛋白。本研究RT-PCR 檢測發現，CC 基因型個體ELL2 mRNA 的表達水平明顯高于CT 和TT 基因型個體。以上結果均表明，ELL2的沉默突變可能導致ELL2表達升高，并可能通過促進Ig 或其他相關基因的選擇性剪接來改變Ig 等相關基因的表達水平，這些改變對多形性腺瘤的發生和惡性轉化至關重要。

綜上所述，本研究發現，ELL2 1119C 等位基因與涎腺多形性腺瘤相關，吸煙與C 等位基因協同作用可增加涎腺多形性腺瘤的發病風險，ELL2基因變異可能在涎腺多形性腺瘤的發生中起重要作用。由于涎腺多形性腺瘤患者術后瘤體樣本量有限，本研究未能對ELL2 不同變異體腺瘤的ELL2 蛋白表達水平進行檢測。后續需進一步通過構建ELL2不同變異體，在細胞水平及動物水平進一步研究ELL2蛋白表達水平及其對下游相關基因表達調控的影響，從而闡明ELL2 的1119T ＞C 變異引起ELL2 表達升高的機制，以及引起涎腺多形性腺瘤發生的分子機制。