HK2 和VDAC1 在二乙酰嗎啡致心肌細胞凋亡中的作用

肖錦玲 ，管雅玲 ，朱森森 ，莊夢婕 ，蘇麗萍 ，蒲紅偉

（1）新疆醫科大學基礎醫學院病理學教研室，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830011;2）新疆醫科大學第一附屬醫院病理科;3）學科建設科，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830011）

目前，藥物濫用仍然是一個全球性的問題。二乙酰嗎啡是一種阿片類激動劑，因其止痛效果和欣快感而經常被濫用[1]。研究表明，凋亡過度可引起心肌細胞結構紊亂及功能障礙[2]。吸食或注射二乙酰嗎啡會損傷心血管系統，使心臟正常生理功能發生障礙，其機制可能與心肌凋亡有關[3]。

己糖激酶（hexokinase，HKs）是一種進化上保守的酶，可以磷酸化六碳糖。己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是HKs 之一，主要存在于脂肪、骨骼肌和心肌等胰島素敏感組織中[4]，其功能之一是直接調節細胞凋亡，被認為是防止細胞器損傷和維持細胞凋亡后活力的潛在靶點[5]。電壓依賴性陰離子通道1（voltage-dependent anion channel 1，VDAC1）是已鑒定的三種哺乳動物亞型中最豐富的，它不僅調節細胞的氧化還原狀態，還介導Ca2+和ROS 等離子在線粒體和細胞質之間的轉移[6]，并可釋放凋亡相關因子進入胞漿，從而導致細胞凋亡[7]。Fan 等[8]學者發現，線粒體通透性轉換孔（mPTP）的重要成員HK2 可以通過與VDAC1 結合并保持其開放構象來交換ATP/ADP，從而維持mPTP 的完整性，防止細胞凋亡，提示HK2 和VDAC1 存在相互作用關系。目前HK2 和VDAC1 在腫瘤中得到廣泛研究，而在二乙酰嗎啡致心肌細胞凋亡中的作用仍不清楚。本研究初步探討HK2 和VDACl 在二乙酰嗎啡致大鼠心肌細胞凋亡中的作用，為進一步探索二乙酰嗎啡導致的心臟損傷提供新的防治靶標。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實驗動物40 只SPF 級SD 大鼠，雌雄不限，體質量（220±30）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SYXK（新）2018-0002，實驗已通過新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗醫學倫理委員會審批（20 200 320-145）。

1.1.2 藥品與試劑二乙酰嗎啡粉劑，純度：90%以上，由新疆維吾爾自治區禁毒總隊提供。HK2、VDAC1、Bcl-2 相關X 蛋白基因（Bcl-2 associated X protein，Bax）、β-肌動蛋白（Betaactin，β-actin）抗體，均由英國Abcam 公司生產。B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B-cellymphoma-2，Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Cysteinylaspartate specific proteinase-3，Caspase-3）抗體，均購自中國Abclonal 公司。Total RNA Kit I 試劑盒，中國北京諾博萊德科技有限公司生產。TUNEL 試劑盒，美國Roche 公司生產。LDH 和GOT 試劑均購自中國索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器CFX96 實時熒光定量PCR 儀，美國伯樂公司產品；BX43 熒光顯微鏡，日本Olymplus 公司產品。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組、二乙酰嗎啡成癮模型構建SD大鼠隨機分為3 組，分別為正常組（Control）、模型組（Model）、模型+10 D 組（Model+10 D）。參照Min Ji[9]的方法，首次皮下注射二乙酰嗎啡劑量為 5 mg/kg，以后逐日劑量遞增法[遞增劑量2.5 mg/（kg·d）] 建立二乙酰嗎啡成癮大鼠模型。模型建立成功后，在此基礎上繼續遞增劑量至第10 天，進一步建立二乙酰嗎啡成癮+10 D 模型。

1.2.2 ELISA 檢測LDH、GOT 含量給藥結束后，腹主動脈采血，采用ELISA 檢測各組大鼠血清GOT、LDH 含量，該實驗重復6 次。

1.2.3 HE 染色觀察心肌組織病理變化將心臟組織固定后，切片等步驟結束后，進行HE 染色，并在光學顯微鏡下觀察心臟組織的形態。

1.2.4 TUNEL 染色檢測心肌凋亡隨機抽取6 張心肌組織石蠟切片，烤片脫蠟等步驟結束后，PBS 洗2 次，配置蛋白酶K∶PBS=1∶200 覆蓋于組織（常溫，15～30 min），PBS 洗2 次，蛋白酶K 覆蓋期間可配置TUNEL 反應液，反應液1∶反應液2=1∶9，每張切片50 μL 反應液覆蓋即可（37 ℃，1 h），PBS 洗3 次進行DAPI 染色（常溫，10 min），最后滴1 滴PBS 在片子上以防干片，熒光顯微鏡下觀察。每張切片在200×視野下隨機選取3～5個視野獲取圖像進行計數，細胞凋亡率為細胞凋亡數（紅色）/總細胞數（藍色）×100%。

1.2.5 免疫組化檢測相關蛋白表達切片標本隨機抽取6 張，EDTA 修復后，滴加HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 一抗（37 ℃，60 min），隨后滴加通用型二抗（37 ℃，15 min）。每張切片在200×視野下隨機選取3～5 個視野獲取圖像，Image J 軟件對圖像進行定量測量，在細胞中觀察到棕色反應顆粒顯示為陽性結果，陽性信號的平均光密度值（AOD＝累積光密度值／視野面積）。

1.2.6 RT-qPCR 檢測心肌組織中相關基因表達將小塊心肌組織剪至平底研磨管，放入研磨儀中研磨（3 次，45 s）。提取組織總RNA 后，上機測260/280>1.8 時合成cDNA。后續按PCR 試劑盒說明書進行操作，以β-actin 作為內參，用2－△△Ct法計算HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 的相對表達，該實驗重復6 次。

1.2.7 Western blot 檢測心肌組織中相關蛋白表達按照心肌組織：RIPA 裂解液=1 mg∶10 μL 比例進行勻漿，離心（4 ℃，20 min，12 000 r/min），離心后取上清液，通過BCA 蛋白定量法（定2 μg/μL）測定蛋白含量后，每組取蛋白3 μL 進行10% SDS-PAGE 電泳，之后將分離的蛋白濕轉至PVDF 膜，用5×脫脂奶粉在搖床中進行封閉（37 ℃，2 h），一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h，通過顯色成像并用Image J 軟件分析灰度值做量化分析，該實驗重復6 次。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 二乙酰嗎啡對大鼠心功能的影響

給藥完畢后，與正常組相比，模型組、模型+10 D 組大鼠血清中的LDH、GOT 表達水平升高（P<0.05），說明損傷隨二乙酰嗎啡干預時間延長而呈遞增趨勢，見圖1。

圖1 各組LDH、GOT 表達水平（，n=6）Fig.1 LDH and GOT levels in each group（，n=6）

2.2 二乙酰嗎啡對大鼠心肌組織形態的影響

正常組心肌細胞排列整齊，心肌間質輕微水腫但未見炎性細胞，心肌組織形態學正常；模型組出現大量的心肌細胞壞死、細胞核散落在細胞外現象或細胞核固縮、溶解現象明顯，炎癥浸潤，肌原纖維絲局部出現斷裂；隨著加藥時間的延長，模型+10 D 組的形態變化比模型組更加明顯，心肌細胞出現明顯損傷，細胞破碎嚴重，肌原纖維絲排列紊亂并且斷裂增多，見圖2。

2.3 TUNEL 染色檢測二乙酰嗎啡對大鼠心肌細胞凋亡的影響

與正常組相比，模型組和模型+10 D 組陽性細胞比例明顯升高（P<0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況（×200）Fig.3 Apoptosis of cardiomyocytes in each group of rats（×200）

2.4 二乙酰嗎啡對心肌組織中HK2、VDAC1 及相關凋亡蛋白的影響

與正常組比較，模型組和模型+10 D 組的心肌組織中HK2 和Bcl-2 蛋白AOD 降低（P<0.05），VDAC1、Bax 和Caspase-3 蛋 白AOD 升 高（P<0.05），見圖4。

圖4 大鼠心肌組織HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達（×200）Fig.4 Expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 protein in rat myocardial tissue（×200）

2.5 二乙酰嗎啡對心肌組織中HK2、VDAC1 及相關凋亡基因的影響

與正常組相比，模型組、模型+10 D 組心肌組織中HK2、Bcl-2 mRNA 表達下調（P<0.05）；VDAC1、Bax、Caspase-3 mRNA 表達 上調（P<0.05），見表1 和圖5。

表1 二乙酰嗎啡對心肌組織中HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達的影響（，n=6）Tab.1 Effects of diamorphine on the mRNA expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in myocardium（，n=6）

表1 二乙酰嗎啡對心肌組織中HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達的影響（，n=6）Tab.1 Effects of diamorphine on the mRNA expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in myocardium（，n=6）

與正常組比較，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。組間比較，#P <0.05。

圖5 大鼠心肌組織HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達（，n=6）Fig.5 Expression of HK2，VDAC1，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 mRNA in rat myocardial tissue（，n=6）

2.6 二乙酰嗎啡對心肌組織HK2、VDAC1 及相關凋亡蛋白的影響

Western blot 結果顯示，與正常組相比，模型組HK2 和Bcl-2 蛋白表達水平下降，VDAC1、Bax、Caspase-3 和Cleaved Caspase-3 蛋白表達水平上升。隨著二乙酰嗎啡干預時間延長，趨勢愈加明顯。上述指標，正常組與模型組或與模型+10 D 組相比，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖6。

圖6 各組心肌組織中HK2、VDAC1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Cleaved Caspase-3 蛋白表達變化（，n=6）Fig.6 Changes in Protein Expression of HK2,VDAC1,Bax,Bcl-2,Caspase-3,and Cleaved Caspase-3 in Myocardial Tissues of Various Groups（，n=6）

3 討論

近年來，阿片類藥物使用率逐年上升，海洛因化學名為二乙酰嗎啡，作為阿片類藥物具有高度成癮性[1]。盡管公眾意識逐漸加強且出現大量新的合成藥物，但二乙酰嗎啡的吸引力并沒有減弱。研究表明二乙酰嗎啡對心血管系統危害極為嚴重[10]，但目前對其具體機制尚不明確，有待進一步深入研究。

杜磊等[11]發現嗎啡治療急性心肌缺血再灌注大鼠后，大鼠的心臟功能有所恢復。本研究結果發現二乙酰嗎啡干預后心肌損傷標志物LDH、GOT 表達水平升高，且心肌組織結構排列紊亂，肌原纖維絲發生斷裂，這與本研究結論不一致，考慮可能原因與藥物給藥劑量與給藥時間長短不同所致。細胞凋亡存在于各種細胞生物中，是一種受促凋亡因子和抗凋亡信號調控的程序性細胞死亡，其生物學特征是半胱天冬酶的激活[12]。國內學者研究發現二乙酰嗎啡會降低視網膜組織抗氧化能力，誘導視網膜細胞凋亡[13]；二乙酰嗎啡對大腦產生各種神經毒性作用，例如灰質喪失、神經元凋亡等[14]；以上研究提示二乙酰嗎啡可使組織器官受損并參與細胞凋亡。本研究通過建立二乙酰嗎啡成癮模型，發現大鼠心肌組織在二乙酰嗎啡干預下有不同程度地損傷，且凋亡率顯著升高，這與劉小山等[15]的研究結果相一致，進一步證實二乙酰嗎啡干預后造成心肌組織損害并發生凋亡。HK2 作為己糖激酶同工酶之一，主要存在于胰島素敏感組織如脂肪、骨骼肌和心肌[16]。有研究表明，HK2 在某些疾病模型上能夠調控細胞凋亡。Song G 等[17]發現類風濕關節炎滑膜中HK2 的表達及其活性增加，沉默HK2 可降低促炎因子的產生和細胞活力，并且誘導細胞凋亡；Kim 等[18]研究表明過氧化氫可誘導心肌細胞凋亡，而預防HK2 下調可能挽救心肌細胞免于凋亡。在哺乳動物中，VDAC 有3 種亞型，其中VDAC1 最豐富，它不僅可以控制能量來源和代謝，還可以調節表觀基因組元件和細胞凋亡[19]，這證明了該蛋白質可作為多種病理中的藥物靶點的潛力。Shoshan-BarmatzV 等[20]學者證明在阿爾茨海默氏病患者的大腦中，表現出高水平的VDAC1，通過靶向干預VDAC1 以防止這種促凋亡活性。宋阿北[21]等表明在結核病中，卡介苗感染能夠引起巨噬細胞發生凋亡并導致VDAC1 表達上調，敲低VDAC1 后能夠降低細胞凋亡相關基因和蛋白的表達。凋亡是癌細胞克服化學抗性的主要機制之一，HK2 可通過在線粒體上表達并與VDAC1結合來抵抗癌細胞的凋亡[22]。Yuan S 等[23]發現內皮抑素可刺激內皮細胞凋亡，誘導HK2 減少，促進VDAC1 積累。既往研究發現通過與VDACl相結合，HK2 能夠抑制凋亡，提高其對化療的抗性[24]。本研究通過免疫組化結果發現，HK2 和Bcl-2 蛋白AOD 顯著下降，VDAC1、Bax、Caspase-3 蛋白AOD 顯著上升。此外，RT-qPCR和Western blot 結果顯示在二乙酰嗎啡成癮模型中HK2 mRNA 和蛋白表達下降，VDAC1 mRNA和蛋白表達升高，隨著干預時間延長，心肌組織損傷加重且凋亡率增加，蛋白表達差異更加顯著，這與國內外學者研究結果相一致，同時，本研究發現抗凋亡因子Bcl-2 表達水平下降，促凋亡因子Bax、Clevead Caspase-3 表達水平升高，進一步提示HK2 和VDAC1 參與了二乙酰嗎啡所致的心肌凋亡。

綜上所述，本研究表明HK2 和VDAC1 都有不同程度地改變，其機制可能與二乙酰嗎啡造成心肌損傷且引起心肌凋亡有關，這些研究結果將為二乙酰嗎啡吸入和注射引起的心肌損傷患者的治療和預防提供了理論依據。但本研究結果是在動物實驗中得到的驗證，并沒有探討HK2 和VDAC1 之間的作用關系，其對凋亡過程的調控機制尚不完善，后續將進一步研究，更好的為之后臨床診斷、治療以及預后提供新思路。