基于網絡藥理學與分子對接預測川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化的作用機制

趙麗娟，曹文慧，翟率宇，韓立坤，白?；?/p>

（1.內蒙古民族大學生命科學與食品學院，內蒙古 通遼 028043；2.內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼 028000）

心血管疾病是全球致死率最高的一種疾病，每年死于該病的人數占全球死亡總數的31%［1］，近年來，由于人口老齡化的不斷增加，心血管疾病患者也在逐年增加。高甘油三酯血癥作為一種臨床常見的血脂異常表現為體內甘油三酯水平的異常升高，升高的甘油三酯水平是心血管疾病的重要危險因素［2］，而動脈粥樣硬化則是導致其發生的主要病理過程［3］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，血管內會出現脂質的聚集和易損斑塊［4］，對動脈粥樣硬化的防治很有必要，目前主要是通過他汀類藥物控制血脂、阿司匹林抗血小板凝集等方式進行治療。從中國傳統醫學角度探討動脈粥樣硬化，將其歸為“中風“”胸痹”等范疇［5］，而高血脂作為其主要致病因素與中國傳統醫學中的“痰濁”等致病學說的闡述具有相似之處［6］。川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）是傘形科草本植物，取用干燥根莖［7］，主要分布于四川，云南、內蒙古等省區也有少量種植。赤芍（Paeoniae lactiflora Pall）來源于毛茛科植物芍藥的干燥根［8］，主要來自內蒙古、遼寧、山西等省區。川芎性質溫和、味道辛辣，能夠活血行氣，祛風止痛。赤芍性質微寒、味道微苦，清熱涼血，散瘀止痛。川芎-赤芍藥對作為活血化瘀藥對被廣泛應用于調節血管再生，目前已有研究發現，它們對動脈粥樣硬化小鼠發揮了治療作用［9-10］，然而具體的作用機制尚不完全明確，本研究以川芎-赤芍藥對和動脈粥樣硬化為研究對象，通過中藥整合藥理學研究平臺推測川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化可能的作用機制，旨為川芎-赤芍藥對在臨床上治療動脈粥樣硬化的應用奠定一定的藥理基礎。

1 材料與方法

1.1 川芎-赤芍有效成分、成分靶點的獲取

TCMSP 數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中使用口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及藥物相似性（drug-like，DL）≥0.18作為條件來篩選川芎、赤芍兩味草藥的有效成分和對應靶點，并使用Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）轉換數據信息。以川芎、赤芍及其各自對應的有效成分、成分靶點作為節點，使用Cytoscape3.8.2軟件進行可視化，構建川芎-赤芍藥對的“有效成分-靶點”網絡，并篩選核心成分。

1.2 動脈粥樣硬化疾病靶點及靶點交集的獲取

用OMIM 數據庫（https：//www.omim.org/）和GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）查找動脈粥樣硬化靶點，并通過Uniprot數據庫進行信息轉換，然后將上述獲得的藥物成分靶點及動脈粥樣硬化靶點導入Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），獲得川芎-赤芍藥對對動脈粥樣硬化產生治療作用的候選靶點Venny圖。

1.3 靶蛋白互作網絡的構建

將藥對治療動脈粥樣硬化的候選靶點使用String 數據庫（https：//cn.string-db.org/）來構建川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化的靶蛋白互作網絡（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），設定物種為人類、最低相互作用閾值為0.4，得到靶蛋白間相互作用關系，將TSV格式的結果文件利用Cytoscape 3.8.2軟件可視化，進行靶點間網絡分析，篩選川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化的核心靶點。

1.4 GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析

使用Metascape數據庫（https：//metascape.org）對川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化疾病的候選靶點進行GO及KEGG富集分析，然后利用RStudio 4.1.3軟件的ggplot2包以氣泡圖形式展示候選靶點主要參與的生物學過程和有關的信號通路。

1.5 川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化“成分-靶點-通路”網絡的構建

再次利用Cytoscape3.8.2軟件以藥物治療疾病的候選靶點、對應的有效成分、疾病名稱和信號通路為節點，構建川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化“有效成分-靶點-通路”網絡，展示藥物有效成分、藥物治療動脈粥樣硬化的候選靶點及信號通路間的相互作用關系。

1.6 分子對接

利用PDB（https：//www.rcsb.org）數據庫下載核心成分的3D 結構，TCMSP 數據庫下載核心靶點的3D結構，將靶點大分子導入PyMOL 2.4.0 軟件去掉水及配體后使用AutoDock Tools 1.5.6 軟件對其加氫、計算電荷數及確定剛性性質，然后在AutoDock Tools 1.5.6軟件進行核心成分與核心靶點的分子對接，得到藥物成分小分子和靶點大分子的結合能，最后用PyMOL 2.4.0軟件對結合部位進行可視化。

2 結果

2.1 川芎-赤芍有效成分及成分靶點的獲取

使用TCMSP數據庫篩選后得到川芎、赤芍的有效成分共35個，兩者分別為7個及29個，有1個共同成分，見表1。

表1 川芎和赤芍的活性成分Tab. 1 Active ingredients of Ligusticum chuanxiong Hort and Paeoniae lactiflora Pall

篩選得到的活性成分對應靶點分別為川芎靶點30個、赤芍靶點102個，通過去重處理后，共得到106個川芎-赤芍靶點。將有效成分與靶點收集篩選后進行數據處理，通過Cytoscape 3.8.2軟件獲得川芎-赤芍藥對的“有效成分-靶點”網絡，見圖1，展示出了川芎-赤芍藥對多成分、多靶點的特點，分析所得度值（Degree）越大有效成分的形狀越大，其與對應靶點的關聯性越多，其有效成分作用也越大，將度值前4位的成分篩選為核心成分，分別為β-谷甾醇（CS8，度值39）、黃芩素（CS6，度值38）、豆甾醇（CS6，度值30）和楊梅酮（CX2，度值26）。

圖1 川芎-赤芍藥對的“有效成分-靶點”網絡Fig. 1 The“active ingredient-target”network of Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair

2.2 動脈粥樣硬化疾病靶點及靶點交集的獲取

使用OMIM數據庫和GeneCards數據庫查找動脈粥樣硬化靶點，去重后得到動脈粥樣硬化對應靶點2467 個。將篩選后的106 個成分靶點與2467 個疾病相關靶點導入Venny2.1.0 軟件，得到58 個共同靶點，為川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化的候選靶點，見圖2。

圖2 川芎-赤芍藥對-動脈粥樣硬化共同靶點韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of common targets of Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair- atherosclerosis

2.3 靶蛋白互作網絡的構建

將58個共同靶點應用String 數據庫得到相互作用節點的靶蛋白-蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI），然后將String數據庫得到的結果文件導入Cytoscape 3.8.2軟件去除落單靶點后繪制更為清晰簡潔的PPI圖，見圖3，靶點的大小與度值成正比，將度值前4的靶點篩選出來作為核心靶點，分別為AKT1（蛋白激酶B，度值41）、TNF（腫瘤壞死因子，度值41）、VEGFA（血管內皮生長因子A，度值35）和TP53（腫瘤蛋白p53，度值34）。推測這些靶點可能為川芎-赤芍藥對對動脈粥樣硬化起到主要作用的靶點。

圖3 川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化的候選靶點PPI網絡Fig. 3 PPI network of candidate targets for the treatment of atherosclerosis with Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair

2.4 GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析

使用Metascape 數據庫，進行候選靶點的GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。GO富集分析得到461個生物學條目（P＜0.01），根據P值展示了前20條，見圖4，包括對氧水平下降的反應、對細菌來源分子的反應、對激素的反應、循環系統過程、磷酸化的正調控等生物學過程。KEGG 富集分析篩選出信號通路137條（P＜0.01），根據P值展示了前20條，見圖5，居首位的通路有癌癥信號通路、脂質和動脈粥樣硬化通路、化學致癌-受體激活通路等，提示川芎-赤芍藥對主要通過這些生物學過程和信號通路對動脈粥樣硬化產生作用。

圖4 川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化的潛在靶點GO分析Fig. 4 GO analysis of potential targets of Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair in the treatment of atherosclerosis

圖5 川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化的潛在靶點KEGG分析Fig. 5 KEGG analysis of potential targets of Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair in the treatment of atherosclerosis

2.5 川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化“成分-靶點-通路”網絡的構建

將上述得到的藥物治療疾病的候選靶點、對應的藥物有效成分、疾病名稱和信號通路輸入到Cytoscape3.8.2 軟件，構建川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化“成分-靶點-通路”網絡，見圖6，結果展示了川芎-赤芍藥對多種有效成分以協同的形式與多個交集靶點、多種信號通路間的相互作用。

2.6 分子對接

對核心成分β-谷甾醇、黃芩素、豆甾醇、楊梅酮和核心靶點AKT1（PDB ID：7MYX）、TNF（PDB ID：1TNF）、VEGFA（PDB ID：4KZN）、TP53（PDB ID：2PCX）分別使用AutoDock Tools 1.5.6軟件進行了分子對接，結合能越低說明受體和配體間親和力越高，結合的結果越可靠，結果見表2，各核心成分和核心靶點的結合能分布在-7.14～-4.61之間，均具有較好的結合能力。將每個核心成分與其結合能力最高的靶點利用PyMOL 2.4.0軟件對結合部位進行可視化，見圖7。

圖7 4種核心成分與靶點對接結果Fig. 7 Docking results of four core components with targets

3 討論

動脈粥樣硬化是一種臨床常見疾病，炎癥是導致其發生的首要因素。中國傳統醫學的發展較為成熟，探究川芎-赤芍藥對對動脈粥樣硬化病理狀態形成過程起到的作用存在現實意義。本研究基于網絡藥理學對川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化可能的作用機制進行了研究預測，篩選出來的35個活性成分對應的靶點與動脈粥樣硬化靶點基因取交集后得到了與動脈粥樣硬化有關的候選靶點58個，川芎-赤芍藥對的“有效成分-靶點”網絡展現了其多種成分和多個靶點間的相互作用，而其核心成分β-谷甾醇、黃芩素、豆甾醇、楊梅酮與核心靶點AKT1、TNF、VEGFA、TP53間的分子對接結果表明了較好的結合能力，證明川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化的可行性。

AKT編碼的蛋白激酶B是一種絲-蘇氨酸蛋白激酶，它共分為3個亞型，其中AKT1主要促進細胞的存活和增殖。PI3K是AKT活性的主要調節物，PI3K-AKT通路能被細胞內的多種刺激因子所活化，包括VEGF，而AKT的過度活化與腫瘤等多種疾病均相關［11］。研究發現，ATK1可使血清中游離的膽固醇和甘油三酯水平明顯下降，并且使內毒素誘導單核細胞/巨噬細胞內促炎介質的分泌減少，有力地證明了AKT1基因靶點在脂質代謝及炎癥調節中起著重要作用［12］。TNF編碼的腫瘤壞死因子是一種多功能的調節因子，參與調節包括細胞增殖和細胞凋亡等多種生物學過程［13］，而TP53編碼的腫瘤蛋白p53是一種腫瘤抑制蛋白，它可以保持基因的穩定性，也能夠調控細胞的生長發育周期［14］，通過調控細胞周期來有效防止疾病的發生。此外，TP53誘導的糖酵解和凋亡調控因子（TIGAR）能夠有效減少糖酵解并保護機體免受氧化應激，與心血管疾病存在密切關聯［15］，且已有研究發現，TIGAR能夠通過減少活性氧（ROS）的產生來減輕氧化還原損傷，進而來調節動脈粥樣硬化的發生及發展［16］。VEGFA（血管內皮生長因子A）主要作用于內皮細胞，影響血管的生成和通透性，在血管穩態中起到了關鍵作用［17］。對候選靶點進行的GO分析和KEGG 分析結果及構建的川芎-赤芍藥對治療動脈粥樣硬化“有效成分-通路-交集靶點-動脈粥樣硬化”網絡展現了川芎-赤芍藥對多成分、多靶點、多通路的作用特點，顯示了多個通路間直接或間接的聯系，對血脂的代謝和細胞的生長發育發揮了正向作用，從而對動脈粥樣硬化的炎癥反應起到了調控作用。

綜上所述，采用川芎-赤芍藥對對動脈粥樣硬化進行防治，涉及多成分、多靶點和相互關聯的多條信號通路，通過對這些基因靶點和信號通路進行研究，了解川芎-赤芍藥對成分可能對動脈粥樣硬化發揮的作用，為該藥物在臨床的應用奠定一定的理論基礎。