全二維氣相色譜-飛行時間質譜技術解析“國槐”木酒海貯存老熟金徽酒揮發性組分特征

馮雨楓，張智良，黃小東，唐 亮，趙江林，郭濤紅，陳 雙，3*，徐 巖，3

（1.江南大學生物工程學院釀造微生物與應用酶學實驗室，江蘇無錫 214122；2.金徽酒股份有限公司，甘肅隴南 742300；3.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122）

金徽酒產自秦嶺南麓徽成盆地、有“隴上江南”美譽的甘肅隴南徽縣，根據記載，金徽酒起源于西漢，盛于唐宋，在明清時期就已經有“西部酒鄉”的美名。在歷史的發展中，金徽酒逐漸形成了低溫入窖、低溫發酵、緩火蒸餾、低溫貯存、低溫過濾等獨特的低溫釀造工藝，造就了金徽酒“只有窖香沒有泥味”的獨特品質，形成了香氣細膩優雅、入口柔和綿甜、入喉圓潤順暢的獨特風格[1]。

貯存老熟作為白酒不可缺少的一步工藝，可以減弱新酒的辛辣感，使酒體變得更加柔和醇厚，不同的貯存容器對白酒的質量與風格有一定影響[2]。木酒海作為金徽酒獨特的貯存容器，其歷史可以追溯到明清年間，那時金徽酒已成規模，陶壇貯存已無法滿足產量需求，先民就以秦嶺盛產的槐木制作酒海，制作時先將槐木切割成3～5 cm 厚作為外殼，再使用纖維極長的枸樹皮或桑樹皮制成薄紙，在槐木內部裱糊上百層后風干制成，制作一個槐木酒海通常需要耗時數月，直至能夠滴酒不漏。金徽現存最早的“國槐”木酒海制于明萬歷八年間，距今已有四百多年，被鑒定為國家一級文物，是中國釀酒史上的一具瑰寶?！耙怨駜?，以酒養柜”，在貯存過程中木酒海賦予了酒體獨特的酒海風味，造就了金徽酒獨具一格的風格特點[3]。

目前用于貯存的酒海除金徽的槐木酒海外，還有鳳香型白酒使用的荊條酒海。荊條酒海是用當地荊條編制成簍，以血料和石灰為黏膠，在其內部用麻紙裱糊百余層，最后再用雞蛋清、蜂蠟、菜籽油按順序涂抹風干后制成的[4]，與槐木酒海的制作工藝有一定差異。針對酒海貯存的研究現在主要集中于鳳香型白酒，劉麗麗等[5]在酒海貯酒中檢測出94 種揮發性物質，通過對不同容器貯酒的揮發性組分對比發現，陶壇與不銹鋼罐風格相似，而酒海具有其特殊性[6]，且與呈果香、甜香、蜜香和杏仁香特征的物質具有較高的相關性。目前對于槐木酒海貯存老熟金徽酒的研究還是空白，為了解木酒海貯存老熟對金徽酒帶來的風格影響，需要對其揮發性組分和物質組成展開全面的解析。

本實驗采用頂空固相微萃?。╤eadspace solidphase microextraction，HS-SPME）、液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）和液液萃取結合正相硅膠色譜分離技術3 種前處理方法，結合全二維氣相色譜-飛行時間質譜（two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GCTOFMS）對“國槐”木酒海貯酒的揮發性組分進行鑒定，為解析木酒海貯酒獨特的香氣特征及貯存老熟機理提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：“國槐”木酒海貯存多糧濃香基酒（酒精度為65.6 %vol）、陶壇貯存多糧濃香基酒（酒精度為70.0%vol），甘肅金徽酒股份有限公司。

試劑及耗材：甲醇、二氯甲烷、乙醚、戊烷（均為色譜純），Sigma-Aldrich（中國上海）公司；其他試劑均為國產分析純。

儀器設備：全二維氣相色譜-飛行時間質譜（GC×GC-TOFMS）儀，Agilent 7890N-Pegasus 4D，美國Agilent、Leco 公司；多功能自動進樣器，德國Gerstel 公司；氮吹儀（N-EVAP111），美國Organomation 公司；Milli-Q 超純水系列，美國密理博公司；固相微萃取三相萃取頭（2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS），美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取方法

參照劉志鵬等[7]的方法，用超純水將白酒樣品稀釋至酒精度為5%vol，然后取5 mL加入到20 mL頂空瓶中，再加入1.6 g NaCl。進樣采用MPS2（Gerstel，德國）多功能自動進樣器進行頂空固相微萃取，萃取條件設置為：樣品于50 ℃下平衡5 min，以400 r/min 攪拌萃取45 min，萃取頭型號為DVB/CAR/PDMS(2 cm，50/30 μm，Supelco，美國）。萃取結束后于250 ℃下脫附5 min，不分流。

1.2.2 液液萃取方法

參照FAN等[8]的方法，進行一定調整。取30 mL酒樣于500 mL分液漏斗中，用飽和食鹽水將酒樣稀釋到10%，以二氯甲烷為萃取劑，依次加入30 mL、20 mL 和10 mL，每次萃取10 min，靜置分層后收集下層有機相，共進行3 次，加入無水硫酸鈉除水后放置于-20 ℃冰箱過夜，最后氮吹濃縮至500 μL并過膜。

1.2.3 液液萃取結合正相硅膠色譜分離技術

參照FAN等[8]的方法，進行一定調整。取50 mL酒樣于500 mL 分液漏斗中，用飽和食鹽水將酒樣稀釋到10%，加入50 mL 的二氯甲烷萃取劑，每次萃取10 min，靜置分層后收集下層有機相，共進行3次，加入無水硫酸鈉除水后放置于-20 ℃冰箱過夜，最后氮吹濃縮至500 μL并過膜。

參照王露露[9]的方法，選擇尺寸為30 cm×1.5 cm的玻璃柱作為分離柱，稱取300～400 目的硅膠顆粒15 g，加入20 mL 甲醇活化過夜后上柱，上樣前分別用50 mL 的甲醇、乙醚和戊烷對色譜柱進行洗脫活化，然后加入液液萃取后的濃縮液，依次用12 個梯度的洗脫溶劑進行洗脫。洗脫溶液體積為50 mL，洗脫溶劑分別為：100 %戊烷、98 %戊烷+2%乙醚、95%戊烷+5%乙醚、90%戊烷+10%乙醚、85 %戊烷+15 %乙醚、80 %戊烷+20 %乙醚、70%戊烷+30%乙醚、30%戊烷+70%乙醚、20%戊烷+80 %乙醚、100 %乙醚、100 %二氯甲烷以及100 %甲醇。將收集到的12 個梯度洗脫溶劑除水后氮吹濃縮至500 μL 并過膜，再用于后期儀器分析。

1.2.4 GC×GC-TOFMS儀器分析方法[9]

全二維氣相色譜條件：第一維色譜柱DBFFAP 毛細管柱（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent），第二維色譜柱Rx-17 Si 毛細管柱（0.8 m×0.25 mm×0.36 μm，Restek）。四噴口雙級熱調制器串聯一維色譜柱和二維色譜柱，傳輸溫度為240 ℃。載氣為He (＞99.999 %)，流速1 mL/min，進樣口溫度為250 ℃。一維色譜柱升溫程序為：初始溫度45 ℃保持3 min，4 ℃/min 升溫至150 ℃保持2 min，6 ℃/min 升溫至200 ℃后再以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持10 min。二維色譜柱的溫度全程比一維色譜柱高5 ℃。調制補償溫度為20 ℃，調制周期為4 s，熱脈沖時間為0.8 s。

飛行時間質譜條件：離子源電壓為70 eV，檢測器電壓為1500 V，溫度為230 ℃，傳輸線溫度240 ℃，離子掃描范圍35～400 amu，掃描頻率100 spestra/s。

1.2.5 數據處理與分析

揮發性化合物鑒定：實驗采集的TOFMS 數據由LECO 公司提供的ChromaTOF?4.61.1.0 軟件進行解析，自動識別信噪比大于200 的色譜峰后與本實驗室建立的包含近3000 種揮發性組分的中國白酒揮發性組分數據庫進行比對分析，然后自動積分和解卷積，并與質譜庫（Wiley9、Nist 和Replib）進行比對，當相似度小于700 時不匹配物質名稱。手動篩去由柱流失產生的化合物以及鹵素化合物等。在相同色譜條件下進樣正構烷烴（C7—C30），確定樣品中各化合物的保留指數（retention index，RI），并與文獻中該物質的RI 值進行比對，當差值小于50時可認為定性結果可信度較高。

對處理好的TOFMS 定性數據進行分類梳理，通過The Good Scents Company 網站（http://www.perflavory.com/search.php）查詢化合物香氣屬性；采用Origin2023軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 GC×GC-TOFMS 法測定“國槐”木酒海貯酒的揮發性組分

采用3 種不同前處理方法結合GC×GCTOFMS 測定木酒海貯酒和陶壇貯酒樣品中揮發性組分，結果見圖1。由圖1 可知，采用液液萃取結合正相硅膠色譜分離技術鑒定出的揮發性組分數量多于HS-SPME 和LLE。HS-SPME 和LLE 是白酒樣品前處理最常用的方法，但濃香型白酒部分香氣區域復雜，可能存在色譜峰掩蓋導致定性結果不理想，正相硅膠色譜分離技術是一種有效的提取香氣化合物的手段，通過不同極性溶劑的梯度洗脫，可以實現復雜樣品香氣的預分離[10]。

圖1 不同前處理方法下木酒海(A)和陶壇(B)貯酒樣品揮發性組分差異

木酒海貯存老熟的金徽酒由于其貯存容器的特殊性，在與實驗室前期建立的白酒風味數據庫進行比對時部分物質并未成功匹配，后期對這些物質準確定性后，將其保留指數、香氣屬性等信息錄入白酒風味數據庫進行擴充。將木酒海貯酒和陶壇貯酒樣品中揮發性組分進行分類整理，結果如表1 所示。由表1 可知，木酒海貯酒中的揮發性組分多于陶壇貯酒，分別為841 種和694 種，其中木酒海貯酒的酯類化合物為173 種，醇類化合物為121 種，酸類化合物為31 種，醛、酮類化合物為133 種，芳香族化合物為140 種，含氧雜環類化合物為73 種，含硫化合物為27 種，含氮化合物為36 種，酚類化合物為16 種，萜類化合物為87 種，其他類為4 種。木酒海貯酒在各類揮發性化合物數量上均高于陶壇貯酒，尤其在萜類化合物、醇類化合物、芳香族化合物、含硫含氮化合物和含氧雜環類化合物的數量上有較大差異。由此可見，木酒海貯酒相較于陶壇貯酒在揮發性組分上更具多樣性。

表1 木酒海貯酒和陶壇貯酒樣品揮發性組分數量及分類

將木酒海貯酒和陶壇貯酒的揮發性組分做對比可得，木酒海貯酒特有的揮發性組分有271 種（見圖2），與陶壇貯酒存在一定的不同。其中占比較大的組分為萜類化合物（21 %）、芳香族化合物（15 %）、醇類（14 %）、酯類（13 %）、醛酮類（13 %）和含氧雜環類化合物（8%）。木酒海貯酒特有的潛在香氣活性物質有154 種（見表2），其中萜類化合物和芳香族化合物占比最大且通常具有獨特的香氣屬性，可能與木酒海貯酒的風格特征有一定關聯，在后續研究中將對這兩類化合物進行重點關注。

表2 木酒海貯特有揮發性物質及潛在香氣活性物質數量及分類

圖2 木酒海貯酒特有揮發性組分的分類占比

2.1.1 萜類化合物

萜類化合物是一種廣泛存在于植物中的天然化合物，也是造成植物細微香氣區別的一類物質。目前萜類物質在葡萄酒中研究較多，對葡萄酒典型香氣特征具有一定貢獻，如3-氧-α-紫羅蘭酮和巨豆三烯酮等萜類化合物含量升高可能是Valpolicella Classico 和Amarone 紅酒產生煙草味的原因[11]，萜類物質的異構體也有一定潛力作為區分葡萄酒品種和產區的標志物[12]。針對白酒中的萜類化合物，范文來等[13]采用GC-MS 在藥香型董酒中檢測并定量了41 種萜類化合物，總含量達到mg/L 級別，其中包括β-大馬士酮、小茴香醇、龍腦等部分萜類物質，對藥香型董酒的香氣具有一定貢獻[14]。

本研究在木酒海貯酒中共鑒定出87 種萜類化合物，遠高于陶壇貯酒（40 種），其中單萜類化合物占43.7 %，倍半萜類占39.1 %，降異戊二烯類占17.2 %。萜類化合物可分為碳氫類、萜烯醇、萜烯醛、萜烯酮、萜烯酯和萜烯醚，木酒海貯酒中有碳氫類32種，萜烯醇35種，萜烯醛3種，萜烯酮13種，萜烯酯2 種和萜烯醚2 種（見圖3）。大部分萜類化合物呈現花果、草本、木質的香氣特征，其中部分萜類閾值較低，可能對金徽酒風味有積極貢獻，如β-大馬士酮（0.05 μg/L[15]）、香葉醇（130 μg/L[16]）、香茅醇（100 μg/L[17]）、芳樟醇（50 μg/L[16]）、香葉基丙酮（60 μg/L[18]）、α-松油醇（400 μg/L[16]）、α-紫羅蘭酮（10.6 μg/L[18]）、β-紫羅蘭酮（0.09 μg/L[19]）等。

圖3 木酒海貯酒中萜類化合物結構式圖

木酒海貯酒特有的萜類物質有56 種，44 種具有香氣屬性（見表3）。其中α-蒎烯、月桂烯、龍腦、胡椒酮、1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘等物質閾值較低；β-蒎烯、檸檬烯、長葉烯、香芹醇、紫蘇醇等具有松香、杜松、葛縷子、蒔蘿等特殊的植物香氣，可能對木酒海貯存老熟金徽酒的風味豐富性有一定貢獻。同時，萜類物質也是一類具有生物活性的物質，例如月桂烯[20]、α-紅沒藥醇[21]、β-桉葉醇[22]、紫蘇醇[23]、香芹酮[24]、檸檬醛[25]等具有抗皮膚光老化、抗炎、促進血管新生、抗糖尿病等生物活性。

表3 木酒海貯酒特有的具有香氣屬性的萜類化合物

“國槐”木酒海貯酒中的萜類化合物數量遠多于陶壇貯酒，可能與其特殊的貯酒容器有關，在長時間的貯存過程中，其內壁植物材料中的物質溶出到酒體中，造就了木酒海貯酒獨具一格的風格特點。

2.1.2 芳香族化合物和酚類化合物

芳香族化合物是一類具有苯環的化合物，結構多樣，包括芳香酯、芳香醇、芳香醛、芳香酮、芳香醚等，呈現不同的香氣特征。酚類化合物是一種羥基直接與苯環相連的化合物，是增加白酒風味豐富度的一類重要呈香物質。

此次在木酒海貯酒中共鑒定出140 種芳香族化合物，其中41 種為木酒海貯酒特有，有21 種具有香氣屬性（見表4），部分化合物具有一定功能活性，如羥基苯乙酮是一種天然存在于云杉、人參和蒿屬植物中的化合物[30]，具有治療酒精性肝病[31]的潛力；甲基丁香酚是我國傳統中藥細辛的主要活性成分，具有鎮痛、抗過敏等藥理作用，有治療急性腎損傷的潛力[32]，同時具有一定抗焦慮作用[33]。酚類化合物是一類對白酒有重要香氣貢獻的化合物，此次在木酒海貯酒中檢測出酚類化合物共15種，愈創木酚（13.41 μg/L）、4-甲基愈創木酚（314.56 μg/L）、4-乙基愈創木酚（122.74 μg/L）及4-乙烯基愈創木酚（209.30 μg/L）閾值較低[34]，呈現煙草、木質、甜香、丁香的氣味，可能對木酒海貯存老熟金徽酒的煙熏和木質香氣有積極貢獻。

表4 木酒海貯酒特有的具有香氣屬性的芳香族化合物

目前研究表明白酒中的芳香族化合物一部分來自于原料中芳香族氨基酸的分解，酪氨酸和苯丙氨酸是關鍵的前體物質，可以進一步轉化成苯乙醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯等重要香氣物質[35]，但關于木酒海貯酒中特有的芳香族化合物的來源尚不明晰。有研究表明白蘭地在橡木桶中陳釀時所增加的芳香族化合物一部分來自橡木桶本身[36]，也有一部分來自橡木桶中的木質素等大分子物質降解和逐步氧化[37]，故推測木酒海貯酒中芳香族化合物的多樣性可能與其木質的貯酒容器有關。

3 結論

本研究基于HS-SPME、液液萃取和液液萃取結合正相硅膠色譜分離技術3 種前處理方法，采用GC×GC-TOFMS 測定“國槐”木酒海貯酒中的揮發性組分并與陶壇貯酒進行對比，對鑒定出的841 種和694 種揮發性物質進行了差異分析。結果表明，木酒海貯酒與陶壇貯酒存在一定差異；對木酒海貯酒特有的271 種物質進行進一步解析后發現，有潛在的香氣活性化合物154 種，除去醇、酸、酯、醛等骨架成分，在木酒海貯酒中鑒定出特有的萜類和芳香化合物分別為44 種和21 種，可能對木酒海的風格特點具有積極貢獻。本研究有助于促進對木酒海貯存老熟金徽酒的揮發性組分的進一步認識，為解析其獨特的香氣特征和老熟機理提供一定的研究基礎。