不同蛋白源代乳粉對羔羊生長、消化、瘤胃發酵參數和菌群結構的影響

■ 王紫薇 梁鴿鴿 魯昌明 張 旭 張永根 謝小來 扈光輝* 路允龍

（1.東北農業大學動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江綠能生態牧業有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 162400）

我國養羊業生產已經逐漸由傳統養殖方式轉變為集約化養殖方式，代乳粉已被推薦用來代替羊奶飼喂羔羊，以解決母羊母乳不足和產羔間期長的問題[1]。目前，代乳粉中蛋白質來源主要有兩種：一種是乳源蛋白（如乳清、脫脂奶粉等）[2]，另一種是植物源蛋白（如大豆、小麥蛋白等）[3]。乳源蛋白因其營養均衡、消化吸收快和利用率高，一直是代乳粉中主要的蛋白質源[4]。與乳源蛋白相比，植物源蛋白因其消化率和溶解度較低，氨基酸結構較差，且含有抗營養因子[4]，目前還沒有被普遍應用[5]。目前，國內外關于不同蛋白源對羔羊生長性能影響的研究已經超過30 年[6]。但鮮有關于用多種植物蛋白組合的代乳粉進行高水平乳蛋白替代（以粗蛋白計，替代＞50%乳源蛋白）用于羔羊上的報道。因此，試驗以全乳源蛋白為對照，旨在探究以12%豆粕粉+8%小麥蛋白粉+30%膨化大米粉等植物蛋白源替代乳蛋白配制的植物源蛋白代乳粉，對羔羊生長、消化性能、瘤胃發酵參數和瘤胃菌群結構的影響，為開發經濟的乳源蛋白替代品提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2022 年1 月—2022 年4 月在黑龍江綠能生態牧業有限公司（東經123.32°、北緯46.19°）進行。

1.2 試驗設計

選擇40 只3 日齡健康、體重相近[（3.55±0.54） kg]的薩能奶山羊公羔羊，飼喂乳源蛋白代乳粉至22 日齡，隨機分為兩組，對照組為乳源蛋白代乳粉（MD）組，試驗組為植物源蛋白代乳粉（PD）組，每組各20只。

1.3 飼養管理

全部試驗羔羊3 日齡內，采用人工飼喂初乳；3 日齡后訓飼乳源蛋白代乳粉（某公司提供）至22 日齡，隨機分組。PD 組在22～24 日齡逐漸過渡為植物源蛋白代乳粉（某公司提供）。羔羊7 日齡時訓飼開食料和干草，正式試驗期間，單欄單圈，羔羊可以自由采食開食料和干草，自由飲水。兩種不同蛋白源代乳粉、開食料和干草的組成及營養水平分別見表1、表2。羔羊代乳粉飼喂量參考喬國華等[7]方案并做適當調整。代乳粉具體飼喂量為：羔羊4～24 日齡100 g/d，每天分4次（06：00、12：00、18：00、22：00）；羔羊25～44 日齡150 g/d，45～64 日齡200 g/d，每天分3 次（08：00、16：00、22：00）。試驗期內，保證羔羊生長所需溫濕度和通風，定期稱重、免疫、更換墊草、羊圈消毒。每天記錄采食量并觀察羔羊的健康情況。試驗正試期40 d，在試驗結束前5 d 進行消化試驗。

表1 代乳粉組成及營養水平（干物質基礎）

表2 開食料和干草組成及營養水平（干物質基礎）

1.4 樣品的采集與指標測定

1.4.1 生長試驗

分別在羔羊第25、45、65 日齡晨飼前稱重，準確記錄羔羊正式試驗期間的代乳粉采食量、精粗料采食量，并計算羔羊平均日增重（ADG）、開食料干物質采食量、干物質采食量（DMI）和料重比（F/G）等。DMI包括羔羊所采食的代乳粉、開食料和干草總的干物質。

1.4.2 消化試驗

試驗結束前5 d 采取全收糞法收集糞樣，鮮糞經硫酸固氮后保存于-20 ℃備用。65 ℃烘干至恒重，粉碎過篩，測定代乳粉、開食料、干草及糞樣中的養分（DM、CP、EE、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、Ca、P）含量，參照張麗英[8]方法進行養分表觀消化率測定。

某營養成分表觀消化率（%）=（食入某營養成分含量-糞中某營養成分含量）/食入某營養成分含量×100

1.4.3 瘤胃內容物采集

試驗結束后，每組隨機選取6 只羔羊，停食16 h、停水8 h 后進行頸靜脈放血屠宰、解剖、取出瘤胃。濾去瘤胃中食糜，測定并記錄每只已宰羔羊的瘤胃液pH，將濾液分裝在凍存管后放液氮罐速凍后轉入-20 ℃冰箱保存。測定氨態氮（NH3-N）和揮發性脂肪酸（VFA）濃度，測定方法參考李闖[9]方法進行。

瘤胃液中細菌16S rDNA 基因高通量測序分析由杭州聯川生物技術股份有限公司完成。采用CTAB法提取每個瘤胃樣品中微生物總DNA，DNA 質量經檢測合格后，將瘤胃液樣品進行16S rDNA V3～V4 區域的擴增、測序，以及分析。

1.5 數據統計與分析

生長性能、消化性能、瘤胃發酵參數和細菌相對豐度等數據利用SPSS 26.0 軟件進行獨立樣本t檢驗，結果用“平均值和標準誤（SEM）”表示，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

羔羊瘤胃樣品經測序獲得的原始數據用 SMRT Link 軟件(V6.0)處理獲得原始序列，對所得到的特征序列和豐度進行物種分類和物種分類注釋，然后進行Alpha多樣性和Beta多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白源代乳粉對羔羊生長發育的影響

由表3 可見，兩組羔羊正式試驗初始體重相近，試驗結束時，PD 組羔羊的終末體重、ADG、開食料干物質采食量和DMI 顯著低于MD 組（P＜0.05），但是兩組羔羊F/G無顯著差異（P＞0.05）。

表3 不同蛋白源代乳粉對羔羊生長性能的影響

2.2 不同蛋白源代乳粉對羔羊飼糧養分表觀消化率的影響

由表4 可見，PD 組羔羊飼糧的CP、EE、Ca 和P 的表觀消化率均顯著低于MD組（P＜0.05），DM表觀消化率有降低的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同蛋白源代乳粉對羔羊養分表觀消化率的影響（%）

2.3 不同蛋白源代乳粉對羔羊瘤胃發酵參數的影響

由表5可見，PD組羔羊瘤胃中NH3-N、、異戊酸濃度顯著高于MD 組（P＜0.05），但兩組間羔羊瘤胃液pH、總揮發性脂肪酸（TVFA）和乙酸濃度、乙丙比值差異不顯著（P＞0.05）。

表5 不同蛋白源代乳粉對羔羊瘤胃發酵參數的影響

2.4 不同蛋白源代乳粉對羔羊瘤胃微生物區系的影響

2.4.1 瘤胃微生物測序

由表6可見，12個羔羊瘤胃內容物DNA樣品共產生885 384 條測序個數，平均每個樣品產生73 782 條有效測序個數，有效數據和原始數據之比為83.84%～92.70%，有效數據中數據質量≥Q20 占96.21%～97.89%，有效數據中數據質量≥Q30 占90.19%～94.09%，有效數據中GC 含量占53.84%～54.77%。說明該測序結果足以反映兩組羔羊瘤胃樣品的實際情況。

表6 瘤胃微生物測序結果

2.4.2 瘤胃微生物操作分類單位（OTU）數量

通過對12 個羔羊瘤胃液樣品進行16S rDNA 測序分析瘤胃微生物OTU 數量，結果如圖1 所示，12 個樣品共產生4 371 個OTU、其中688 個為兩組共有，MD 組特有的OTU 數量為2 358 個，PD 組特有的OTU數量為1 325 個，PD 組與MD 組相比，差異OTU 數量為3 683個。

圖1 瘤胃菌群韋恩圖

2.4.3 Alpha多樣性分析

如圖2 所示，紅線和藍線分別代表MD 組和PD組，每組羔羊有6 個瘤胃樣品，橫坐標代表隨機抽取的序列數，縱坐標分別代表抽取相同序列數時各樣本中OTU 指數和Shannon 指數大小。隨著測序數的增加，當樣品測序深度達到10 000時，Shannon指數已趨于平緩，說明當前測序量滿足樣品菌群多樣性分析。由表7 可知，兩組羔羊瘤胃區系微生物覆蓋率均為100%，說明樣品足以反映其瘤胃菌群情況；與MD 組相比，PD 組羔羊瘤胃中Chao1 指數、OTU 數量、Shannon 指數、Evenness 指數以及Simpson 指數顯著降低（P＜0.05）。

圖2 瘤胃細菌OTU稀釋曲線（A）和Shannon稀釋曲線（B）

表7 Alpha多樣性指數

2.4.4 Beta多樣性分析

主坐標分析（PCoA）如圖3 所示。第一主成分（PCoA1）和第二主成分（PCoA2）分別表示分離樣品為30.01%、19.31%的方差，PD 組和MD 組羔羊瘤胃菌群明顯分離，表明兩組羔羊瘤胃微生物間結構差異顯著（P＜0.05）。

圖3 基于Unweighted Unifrac距離的PCoA

2.4.5 瘤胃微生物豐富度分析

門水平上，結果如表8 所示。兩組羔羊瘤胃液中的優勢菌門均是厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門；其中，厚壁菌門和擬桿菌門是MD 組和PD 組羔羊瘤胃中最豐富的菌門。與MD 組相比，PD 組羔羊瘤胃中厚壁菌門相對豐度和厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）值顯著降低（P＜0.05）；擬桿菌門的相對豐度顯著提高（P＜0.05）；與MD 組相比，PD 組羔羊瘤胃中放線菌門的相對豐度顯著降低（P＜0.05）；髕骨菌門的相對豐度顯著增加（P＜0.05）；脫硫桿菌門的相對豐度顯著降低（P＜0.05）；組內其他菌門無顯著差異（P＞0.05）。屬水平上，結果如表9 所示。MD 組羔羊瘤胃中優勢菌屬為克里斯滕森氏菌科R-7 群、未分類鼠桿菌科和UCG-002；PD 組羔羊瘤胃中優勢菌屬為未分類鼠桿菌科、普雷沃氏菌屬和克里斯滕森氏菌科R-7 群。與MD 組相比，PD 組羔羊瘤胃中克里斯滕森氏菌科R-7 群、UCG-002 和未分類厚壁菌門屬的相對豐度顯著降低（P＜0.05）；未分類鼠桿菌科、普雷沃氏菌屬、未分類梭菌屬_UCG-014 的相對豐度顯著提高（P＜0.05），組間其他菌屬豐度無顯著差異（P＞0.05）。

表8 門水平相對豐度（豐度TOP10）（%）

表9 屬水平相對豐度（豐度TOP 10）（%）

3 討論

3.1 不同蛋白源代乳粉對羔羊生長性能的影響

多項研究表明，以植物源蛋白部分替代全乳蛋白配制代乳粉時，因代乳粉中蛋白質的來源、替代比例、加工工藝等不同，對哺乳期反芻動物生長性能的影響也不同[10-11]。本試驗中豆粕粉和膨化大米粉的加工方式為膨化工藝（生產公司數據表明膨化大米粉中幾乎不含有抗營養因子）。劉華[12]試驗結果表明，谷物膨化加工可提高谷物內淀粉的消化率，減少抗營養因子的產生。本試驗中，以12% 豆粕粉+8%小麥蛋白粉+30%膨化大米粉為植物源蛋白替代乳源蛋白飼喂25～64 日齡羔羊時，PD 組羔羊的ADG、DMI 分別顯著低于MD 組，但兩組間羔羊F/G 無顯著差異。究其原因，可能與植物蛋白的加工工藝相關，豆粕粉、小麥蛋白粉和膨化大米粉未經有效地加工處理，影響了羔羊的生長性能。

3.2 不同蛋白源代乳粉對羔羊消化性能的影響

哺乳期反芻動物的消化系統發育不良，無法消化大量碳水化合物、脂肪和蛋白質[13]。本試驗中，植物源蛋白代乳粉組羔羊的CP、EE、Ca、P 表觀消化率顯著低于乳源蛋白代乳粉組?？梢?，與乳源蛋白相比，植物源蛋白代乳粉影響了羔羊消化性能。大量研究表明，乳蛋白易被吸收；用植物源蛋白代乳粉會導致皺胃中凝乳形成受損，增加皺胃排空率，進而降低蛋白質和脂肪的消化率；植物源蛋白中的大豆蛋白可以誘導膽汁酸升高，降低脂肪的可用性；與酪蛋白不同，磷酸化較少的大豆蛋白也會誘導磷酸鈣沉積物的積累，減少礦物質的利用[16-20]；與試驗結果一致。

3.3 不同蛋白源代乳粉對羔羊瘤胃發酵參數的影響

反芻動物瘤胃液pH 是反映瘤胃發酵狀況的重要指標[21]。本試驗兩組羔羊瘤胃pH 均在正常范圍內（5.5～7.5）[9]，且差異不顯著，這與黃開武[21]所配制的代乳粉飼喂21～63 日齡的犢牛，各組犢牛瘤胃液pH 均在正常范圍且無明顯差異的結果一致。說明不同蛋白源代乳粉不會導致羔羊瘤胃pH異常。

瘤胃NH3-N 濃度可以粗略反映飼糧中蛋白質降解與微生物蛋白合成速率之間的關系[22-23]。在本試驗中，兩組羔羊瘤胃NH3-N 濃度均在合理濃度范圍（5.0～30.0 mg/dL）[23-24]，但是PD 組羔羊NH3-N 濃度顯著高于MD 組。這與之前研究，全乳源蛋白和多種植物源蛋白組合配制的代乳粉對犢牛瘤胃中NH3-N 濃度無明顯影響的結果不一致[21]，可能受代乳粉中蛋白質來源、加工工藝和替代乳比例等影響。本試驗結果表明植物源蛋白代乳粉可能會影響羔羊瘤胃中微生物蛋白的合成效率。

VFAs 是反芻動物瘤胃內碳水化合物發酵的主要產物，在促進瘤胃乳頭發育、瘤胃微生物對終產物的消化吸收和利用方面至關重要[25]。本試驗中，PD 組顯著提高了羔羊瘤胃總揮發酸中異戊酸的比例。異戊酸是瘤胃內纖維分解菌生長繁殖所必需的因子[21]，對于植物纖維素的降解至關重要。綜上所述，植物源蛋白代乳粉可以促進羔羊瘤胃發酵，是否能夠促進其瘤胃的發育，還需進一步研究。

3.4 不同蛋白源代乳粉對羔羊瘤胃微生物區系的影響

3.4.1 瘤胃微生物多樣性分析

瘤胃及其微生物生態系統對反芻動物的整體營養和健康起著核心作用，其中細菌是瘤胃中最具優勢和多樣性的微生物群落[26]。MD 組和PD 組特有細菌數分別為2 358 個、1 325 個，而共有細菌數僅688 個，說明不同蛋白源代乳粉條件下的羔羊瘤胃中細菌種類存在差異。本試驗中兩組羔羊微生物覆蓋率相同，但PD 組的OTU 數量、Shannon 指數、Simpson 指數、Chao1 指數和Evenness 指數均顯著低于MD 組，說明PD 組瘤胃細菌的多樣性和豐富度相對較低。PCoA圖顯示，兩組羔羊瘤胃樣品完全分離，表明兩組羔羊瘤胃微生物群落結構存在顯著差異。綜上所述，植物源蛋白代乳粉可以改變羔羊瘤胃菌群的結構、影響菌群的多樣性和豐富度。

3.4.2 瘤胃微生物豐富度分析

飼糧是影響反芻動物瘤胃菌群的主要因素[27]，微生物群可以通過從飼糧中提取能量來影響宿主的脂肪沉積，其效率取決于群落組成[28]。本試驗中，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是MD 組和PD 組羔羊瘤胃中的優勢菌門；PD 組羔羊瘤胃中擬桿菌門的豐度顯著高于MD 組，而厚壁菌門的豐度和F/B值顯著低于MD 組。綜上所述，不同蛋白源代乳粉不會改變羔羊瘤胃的優勢菌門的核心地位和有害菌門的豐度；而PD 組羔羊瘤胃F/B 值顯著降低，這與本試驗發現PD 組羔羊的生長性能低于MD 組的結果相符合。

在屬水平上，鼠桿菌科作為一種有益菌，在調節炎癥和維持腸道穩定方面具有重要作用[28]。擬桿菌門與機體生長發育以及機體內碳水化合物、多糖等物質的代謝有關[30]。研究中，未分類鼠桿菌科是PD 組相對豐度最高的菌屬，與MD 組相比，組間差異顯著，說明植物源蛋白代乳粉在一定程度上可以維持羔羊的健康和腸道穩態。PD 組普雷沃氏菌屬豐度居次高，為10.53%，顯著高于MD 組5.59%，這與以往研究發現，普雷沃氏菌屬占反芻動物瘤胃菌群總菌屬的42%～60%的結果不同[31]，該結果的差異可能是由于羔羊所采食飼糧的差異所致。普雷沃氏菌屬可以降解蛋白質、淀粉和木聚糖等營養物質，可以提高飼料利用率[32]。PD 組羔羊瘤胃克里斯滕森氏菌科R-7群、未分類厚壁菌門屬以及瘤胃球菌屬UCG-002 豐度均顯著低于MD 組，而未分類梭狀芽孢桿菌_UCG-014 豐度顯著高于MD 組?？死锼闺暇芌-7 群可以通過增加乳頭寬度、上皮和角質層厚度來促進瘤胃發育[33]；瘤胃球菌是瘤胃中主要的纖維降解細菌，其豐度的變化可顯著改變瘤胃營養物質的消化和利用[32，34]；未分類梭菌屬_UCG-014 是種有益菌，可維持腸道環境的穩定[35]。此結果的出現，與本研究發現的植物源蛋白代乳粉飼喂的羔羊，其生長性能和消化性能低于乳源蛋白的結果相符，至于植物源蛋白代乳粉是否有利于羔羊瘤胃的發育，還需進一步研究。

4 結論

與全乳源蛋白代乳粉相比，以植物源蛋白替代乳蛋白配制的代乳粉會降低羔羊的生長消化性能，此外，植物源蛋白代乳粉可以改變羔羊瘤胃發酵參數和瘤胃菌群結構，提高了羔羊瘤胃中異戊酸和NH3-N的濃度，促進蛋白質和淀粉降解菌的富集，有利于羔羊瘤胃的發酵，但是否能促進羔羊瘤胃發育還需進一步探究。