麝香保心丸調節PINK1/Parkin 信號通路對糖尿病視網膜病變大鼠的影響*

余玲，楊洋，段程慧，董瑞鴻，桑艷紅

（鄭州大學第五附屬醫院內分泌科，鄭州 450052）

目前糖尿病已經成為全球公共衛生問題，未來中國糖尿病患者數量將位居世界第一[1]。而糖尿病視網膜病變（DR）是由糖尿病引起的主要微血管并發癥之一，也是世界上最常見的導致視力喪失的疾病之一，嚴重影響患者的正常生活。目前對于DR 的治療方式有基本治療、激光治療、切除術治療、藥物治療等多種手段，其中基本治療、激光治療、手術治療都有一定的治療效果，但仍存在一定的缺陷及風險，藥物治療相對科學、保守，但是中、西藥治療各有優劣，兩者相結合成為治療DR 的重要方向。研究發現線粒體自噬與DR 相關，在高糖環境下，視網膜細胞線粒體受損，激活線粒體自噬，導致線粒體能量損失加重，從而引起糖尿病視網膜病變[2]。而PTEN 誘導激酶蛋白1（PINK1）/細胞質E3-泛素連接酶（Parkin）信號通路是線粒體自噬的關鍵通路，參與線粒體自噬過程。研究顯示，胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物可以通過抑制PINK1、Parkin 的表達減少線粒體自噬，從而對視網膜神經細胞起到神經保護作用[3]。所以抑制線粒體自噬可能是治療DR的有效靶點。麝香保心丸是臨床治療常用的中成藥，具有芳香溫通、益氣強心之效，另外發現麝香保心丸可以改善糖尿病微循環障礙，降低血液黏度，改善紅細胞聚集度，減輕因糖尿病引起的毛細血管損壞[4]。有研究顯示，糖尿病腎?。―N）和DR 均是糖尿病并發癥，而尿微量蛋白/肌酐比值與糖尿病并發癥密切相關，麝香保心丸可以降低尿微量蛋白/肌酐比值，預防DR、糖尿病[5]。目前還沒有關于麝香保心丸針對DR 的研究，本研究主要探索麝香保心丸對DR 大鼠線粒體自噬及PINK1/Parkin 信號通路的影響，以期為DR 的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 體質量（200±20）g 無特定病原體（SPF）級健康雄性大鼠，90 只，購于湖北貝恩特生物科技有限公司[SCXK（鄂）2021-0027]。麝香保心丸（SBP，Z31020068）購于上海和黃藥業有限公司。雷帕霉素（S1039）購于美國Selleck 公司。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（G11120）購于北京Solarbio 公司；鏈脲佐菌素（STZ）購于美國Sigma 公司；血管內皮生長因子（VEGF，PV960）、高遷移率族蛋白1（HMGB1，PH406）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購于上海碧云天公司；選擇性自噬接頭蛋白sequestosome-1（SQSTM1/P62，sc-48402）、微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ，sc-398822）、PINK1（sc-517353）、Parkin（sc-32282） 抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 DR 模型制備 適應性飼養大鼠1 周，除正常組大鼠外所有大鼠給予高脂飼料喂養14 d，然后采用一次性尾靜脈注射STZ 50 mg/kg 建立糖尿病模型[6]。于STZ 注射72 h 后測定大鼠空腹血糖（FPG），選取FPG≥16.7 mmoL/L 的大鼠作為糖尿病大鼠。繼續飼養1 周后，隨機選擇5 只大鼠進行HE染色觀察視網膜病理變化，視網膜發生病變則表明建模成功。正常組大鼠正常飼料喂養，尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1.2.2 分組處理 將大鼠隨機分為正常組（Control 組）、模型組（DR 組）、麝香保心丸低劑量組（SBP-L 組）、麝香保心丸高劑量組（SBP-H 組）、麝香保心丸高劑量+雷帕霉素組（SBP-H+RAP 組）[7-8]，每組18 只。SBP-L 組：造模成功后麝香保心丸25 mg/kg 灌胃；SBP-H 組：造模成功后麝香保心丸50 mg/kg 灌胃；SBP-H+RAP 組：造模成功后麝香保心丸50 mg/kg灌胃及雷帕霉素1 mg/kg 灌胃；正常組和模型組灌胃與SBP-L 組、SBP-H 組等量的生理鹽水，正常組、模型組、SBP-L 組、SBP-H 組灌胃與SBP-H+RAP組灌胃雷帕霉素等量的生理鹽水。麝香保心丸用生理鹽水配置成混懸液進行灌胃，每天給藥1 次，連續12 周。

1.2.3 血糖血脂水平檢測 末次給藥結束后，用采血針對大鼠腹主動脈取血，血糖儀檢測FPG 水平，全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.2.4 HE 染色 取血結束后，各組分別隨機選擇6 只大鼠處死并摘取右側眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網膜組織，生理鹽水漂洗、濾紙吸干，放入4%多聚甲醛固定，脫水、二甲苯透明，石蠟包埋切片，以備用。再將石蠟切片脫蠟復水，HE 染色，脫水、透明、封片，光學顯微鏡觀察各組大鼠視網膜病變情況。

1.2.5 ELISA 取腹主動脈血，離心半徑15 cm，3 000 r/min，離心10 min 后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中VEGF 水平。

1.2.6 線粒體形態觀察 每組隨機選取6 只大鼠視網膜組織，加入戊二醛溶液固定細胞，脫水、包埋，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，脫水、透明、封片，透射電鏡觀察線粒體形態。

1.2.7 免疫組織化學 取1.2.4 制作的石蠟切片，脫蠟復水，加SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗在室溫下孵育1 h。DAB 顯色，蘇木精復染，沖洗后脫水，二甲苯透明、封片，顯微鏡觀察拍照，并用Image J 軟件分析。

1.2.8 蛋白免疫印跡 選擇各組剩余的6 只大鼠，斷頸處死，迅速取出大鼠的右側眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網膜組織，生理鹽水漂洗干凈后置于離心管中，加入RIPA 裂解液裂解，電泳，并轉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，含有5%脫脂奶粉封閉液封閉。加入一抗，4 ℃下孵育過夜，洗膜，加二抗室溫孵育2 h，洗膜，加ECL 孵育1 min，采集圖像并分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 麝香保心丸對大鼠血糖血脂水平影響 與Control 組比較，DR 組FPG、TC、TG、LDL-C 水平顯著升高（P<0.05）；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H組FPG、TC、TG、LDL-C 水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-L 組比較，SBP-H 組FPG、TC、TG、LDL-C 水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP組FPG、TC、TG、LDL-C 水平顯著升高（P<0.05）。見表1。

表1 麝香保心丸對大鼠FPG、TC、TG、LDL-C 水平的影響（±s）Tab.1 Effects of Shexiang Baoxin Pill on levels of FPG，TC，TG and LDL-C of rats（±s）

表1 麝香保心丸對大鼠FPG、TC、TG、LDL-C 水平的影響（±s）Tab.1 Effects of Shexiang Baoxin Pill on levels of FPG，TC，TG and LDL-C of rats（±s）

注：與Control 組比較，*P<0.05；與DR 組比較，#P<0.05；與SBPL 組比較，△P<0.05；與SBP-H 組比較，▲P<0.05。

LDL-C（mmol/L）Control 組 18 8.52±0.94 1.52±0.23 0.83±0.09 0.41±0.05 DR 組 18 36.78±4.67* 4.67±0.58* 3.14±0.36* 1.89±0.24*SBP-L 組 18 27.86±3.21# 3.35±0.42# 2.32±0.25# 1.38±0.17#SBP-H 組 18 15.53±2.54#△2.19±0.35#△ 1.36±0.15#△ 0.69±0.08#△SBP-H+RAP 組 18 29.63±3.58▲ 3.86±0.51▲ 2.57±0.28▲ 1.56±0.21▲組別 動物數 FPG（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）

2.2 麝香保心丸對大鼠視網膜病變影響 Control 組視網膜結構層次清晰，細胞排列整齊有序；與Control 組比較，DR 組視網膜結構破壞嚴重，細胞排列紊亂，水腫明顯，細胞間隙變寬；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H 組視網膜細胞結構破壞減少，細胞排列逐漸整齊，細胞水腫減輕，細胞形態趨于正常；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組視網膜細胞結構破壞加重，細胞排列紊亂，水腫明顯。見圖1。

圖1 HE 染色觀察各組大鼠視網膜病理形態Fig.1 HE staining was used to observe the pathological morphology of retina of rats in each group

2.3 麝香保心丸對大鼠視網膜病變相關蛋白的影響 與Control 組比較，DR 組VEGF、HMGB1 水平顯著升高（P<0.05）；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H組VEGF、HMGB1 水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-L組比較，SBP-H 組VEGF、HMGB1 水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組VEGF、HMGB1 水平顯著升高（P<0.05）。見表2。

表2 麝香保心丸對大鼠VEGF、HMGB1 水平的影響（±s）Tab.2 Effects of Shexiang Baoxin Pill on VEGF and HMGB1 levels of rats（±s）

表2 麝香保心丸對大鼠VEGF、HMGB1 水平的影響（±s）Tab.2 Effects of Shexiang Baoxin Pill on VEGF and HMGB1 levels of rats（±s）

注：與Control 組比較，*P<0.05；與DR 組比較，#P<0.05；與SBP-L組比較，△P<0.05；與SBP-H 組比較，▲P<0.05。

組別 動物數 VEGF（pg/mL） HMGB1（ng/mL）Control 組 6 85.69± 6.32 4.96±0.51 DR 組 6 263.51±20.17* 23.48±1.87*SBP-L 組 6 204.17±16.74# 17.21±1.41#SBP-H 組 6 126.45±10.13#△ 8.57±5.33#△SBP-H+RAP 組 6 187.34±14.33▲ 15.35±1.16▲

2.4 麝香保心丸對大鼠視網膜細胞線粒體結構的影響 Control 組線粒體呈梭形，嵴保存完整；與Control組比較，DR 組線粒體結構遭到破壞，線粒體腫脹明顯，形態異常；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H 組線粒體形態趨于正常，腫脹減輕；與SBP-L 組比較，SBP-H 組視網膜細胞線粒體結構改善更明顯；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組線粒體腫脹加重，形態異常。見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠視網膜細胞線粒體結構Fig.2 Mitochondrial structure of retinal cells of rats in each group observed by transmission electron microscopy

2.5 麝香保心丸對大鼠視網膜線粒體自噬相關蛋白SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ的影響 與Control 組比較，DR 組SQSTM1/P62 蛋白表達水平顯著降低，LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H 組SQSTM1/P62 蛋白表達水平依次顯著升高，LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-L 組比較，SBP-H 組SQSTM1/P62表達顯著升高，LC3-Ⅱ表達顯著降低（P<0.05）；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組SQSTM1/P62 蛋白表達水平顯著降低，LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖3、表3。

圖3 免疫組化檢測各組大鼠SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ蛋白表達水平Fig.3 Immunohistochemical detection of SQSTM1/P62，LC3-Ⅱprotein expression levels of rats in each group

表3 麝香保心丸對大鼠SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ蛋白的影響（±s）Tab.3 Effects of Shexiang Baoxin Pill on SQSTM1/P62，LC3-Ⅱprotein of rats（±s）

表3 麝香保心丸對大鼠SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ蛋白的影響（±s）Tab.3 Effects of Shexiang Baoxin Pill on SQSTM1/P62，LC3-Ⅱprotein of rats（±s）

注：與Control 組比較，*P<0.05；與DR 組比較，#P<0.05；與SBPL 組比較，△P<0.05；與SBP-H 組比較，▲P<0.05。

LC3-Ⅱ（光密度值）Control 組 6 0.95±0.10 0.32±0.03 DR 組 6 0.44±0.04* 0.76±0.08*SBP-L 組 6 0.62±0.06# 0.64±0.10#SBP-H 組 6 0.87±0.09#△ 0.42±0.11#△SBP-H+RAP 組 6 0.53±0.05▲ 0.68±0.07▲組別 動物數 SQSTM1/P62（光密度值）

2.6 麝香保心丸對各組大鼠PINK1/Parkin 信號通路的影響 與Control 組比較，DR 組PINK1、Parkin蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H 組PINK1、Parkin 蛋白表達水平依次顯著降低（P<0.05）；與SBP-L 組比較，SBP-H組PINK1、Parkin 蛋白表達顯著降低（P<0.05）。與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組PINK1、Parkin 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖4、表4。

圖4 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠PINK1、Parkin蛋白表達Fig.4 Western Blot analysis of PINK1 and Parkin protein expression of rats in each group

表4 麝香保心丸對大鼠PINK1、Parkin 蛋白的影響（±s）Tab.4 Effects of Shexiang Baoxin Pill on PINK1 and Parkin proteins of rats（±s）

表4 麝香保心丸對大鼠PINK1、Parkin 蛋白的影響（±s）Tab.4 Effects of Shexiang Baoxin Pill on PINK1 and Parkin proteins of rats（±s）

注：與Control 組比較，*P<0.05；與DR 組比較，#P<0.05；與SBP-L組比較，△P<0.05；與SBP-H 組比較，▲P<0.05。

組別 動物數 PINK1 Parkin Control 組 6 0.63±0.07 0.43±0.04 DR 組 6 1.25±0.13* 1.06±0.11*SBP-L 組 6 1.05±0.12# 0.81±0.10#SBP-H 組 6 0.68±0.09#△ 0.35±0.07#△SBP-H+RAP 組 6 1.17±0.12▲ 0.77±0.10▲

3 討論

DR 主要是由于高血糖及胰島素信號通路缺陷造成多種病理性并發癥，從而導致視網膜微血管缺陷及神經視網膜功能障礙[9]。其中高血糖是引起DR根本原因。研究顯示麝香保心丸具有降血糖、血脂功效[10]。本研究發現麝香保心丸可以降低DR 大鼠體內FPG、TC、TG、LDL-C 水平，保護視網膜細胞結構破壞，減輕細胞水腫，穩定細胞形態。另外，VEGF是血管內皮細胞特異的促有絲分裂素，特異性地作用于視網膜血管內皮細胞，高糖可引起VEGF 過表達，從而增加血管的滲透性，導致血管異常生長，而抑制VEGF 的表達可以保護視網膜內皮細胞，防止微血管發生病變[11-12]。HMGB1 作為晚期炎癥因子，參與炎癥反應、細胞凋亡、血管新生等過程，高糖刺激視網膜血管內皮細胞中HMGB1 過表達，抑制HMGB1 表達可以減輕DR，保護視網膜內皮細胞[13]。本研究結果顯示，麝香保心丸可以降低VEGF、HMGB1 水平，說明麝香保心丸可以保護視網膜內皮細胞，可以用于治療糖尿病引起的視網膜病變。

自噬是一種基因調控的程序性細胞代謝過程，它可以將對細胞有害無用的蛋白質及受損功能失調的細胞器轉移到溶酶體，然后進行功能性降解以維持細胞穩態[11]。線粒體自噬也是自噬的一種，可以降解受損的線粒體及調控線粒體總體質量，從而調控細胞穩態。然而在能量需求高的細胞中，過度的線粒體自噬可能導致剩余線粒體能量的損失，從而引起細胞死亡[12]。研究顯示，降低線粒體自噬，可以緩解線粒體形態惡化，防止糖尿病患者視網膜神經性退變[13]。另外有研究顯示，抑制LC3 的表達，促進SQSTM1/P62 的表達可以抑制腦組織的自噬水平，從而緩解腦組織損傷，降低腦組織凋亡程度[14]。LC3是自噬相關蛋白標志物，自噬發起時，胞漿型LC3-Ⅰ可以酶解一小段多肽形成自噬體LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值大小可用于評估自噬水平高低。SQSTM1/P62 是一種與LC3-Ⅱ相互作用的銜接蛋白，在自噬的過程中可以被降解[15]。本研究顯示，DR 大鼠SQSTM1/P62蛋白表達水平降低，LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高，線粒體自噬能力增強，麝香保心丸可以上調SQSTM1/P62 表達，下調LC3-Ⅱ蛋白表達，抑制DR 大鼠線粒體自噬。

PINK1/Parkin 信號通路是迄今為止研究最多的線粒體自噬機制之一，也是神經退行性疾病中研究最廣泛的自噬機制之一[16]。PINK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，負責激活并將Parkin 從細胞質轉運到受損的線粒體。Parkin 是一種胞質E3-泛素連接酶，主要位于胞漿[17]。當線粒體受損時，PINK1 迅速聚集在線粒體外膜，促使Parkin 磷酸化，然后與SQSTM1、LC3B 反應將泛素化線粒體傳遞到自噬小體中，形成線粒體自噬小體，從而清除受損的線粒體[18-20]。有研究顯示，黃芪丹參湯通過抑制PINK1/Parkin 介導的線粒體自噬保護糖尿病引起的腎損傷[21]。另外有研究顯示，PTEN-L 可以抑制PINK1/Parkin 信號通路從而減少線粒體自噬，達到維持線粒體穩態目的[22]。本研究發現，DR 大鼠PINK1、Parkin 表達上調，線粒體自噬能力增強，麝香保心丸可以下調PINK1、Parkin 表達，降低線粒體自噬能力，從而保護DR，自噬激活劑可逆轉麝香保心丸的作用，證明麝香保心丸可以通過抑制PINK1/Parkin 信號通路抑制DR大鼠線粒體自噬。

綜上所述，麝香保心丸可以通過抑制PINK1/Parkin 信號通路抑制DR 大鼠線粒體自噬。但本研究尚存在局限性，線粒體自噬具有雙重作用機制，在DR 中發揮的作用機制還尚不明確，需要進一步驗證。