巨噬細胞轉分化在腎纖維化中的調控機制

楊艷燕 陶濤 羅朋立

腎纖維化是所有慢性腎病發展至終末期腎病的最后共同通路，表現為大量成纖維細胞及肌成纖維細胞增殖，細胞外基質過度沉積而導致腎小球硬化、腎小管間質纖維化，最終造成腎功能喪失。腎移植是治療各種終末期腎病的有效手段，但術后多種原因可導致移植腎發生纖維化，嚴重影響受者生存質量。肌成纖維細胞是導致膠原產生和細胞外基質過度沉積的主要細胞類型，是腎纖維化過程中的主要效應細胞[1]，但其來源一直備受爭議。既往研究認為，肌成纖維細胞來源于固有成纖維細胞、上皮-間充質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、內皮-間充質轉化（endothelial- mesenchymal transition，EndMT）和周細胞等[2-8]。巨噬細胞是炎癥和纖維化的關鍵調節細胞[5-6]，活化的巨噬細胞可以產生和分泌多種炎癥因子和趨化因子，參與腎臟炎癥反應、細胞外基質代謝、腎小球硬化和腎間質纖維化。研究表明，在一定病理條件下，巨噬細胞也可直接向肌成纖維細胞轉分化，導致纖維化，這一過程稱為巨噬細胞-肌成纖維細胞轉分化（macrophage-myofibroblast transition，MMT），由巨噬細胞轉化而來的肌成纖維細胞占組織中肌成纖維細胞總數的35%～65%[9]。本文就MMT 的特點及調控MMT 可能的分子機制做一綜述，旨在為腎纖維化的機制研究提供參考。

1 巨噬細胞概述

1.1 巨噬細胞來源及分類

巨噬細胞源自單核細胞，而單核細胞又來源于骨髓中的前體細胞。巨噬細胞是先天性免疫細胞，具有維持組織內穩態和宿主防御功能[10-11]。巨噬細胞根據其來源可分為骨髓來源巨噬細胞和組織固有巨噬細胞；根據其功能、活化程度以及分泌因子的不同，可分為M1 型和M2 型；根據淋巴細胞抗原6C（lymphocyte antigen 6C，Ly6C）水平，又可分為CD11b+/Ly6Chigh、CD11b+/Ly6Cintermediate、CD11b+/Ly6Clow3 個亞型[12]。

1.2 巨噬細胞的異質性與可塑性

巨噬細胞具有高度的異質性和多樣性，根據其局部微環境、疾病類型和疾病的不同階段，表現出不同的表型和明顯的功能差異。當巨噬細胞在體外受到γ-干擾素、脂多糖等刺激時，可活化為M1 型，即經典活化型巨噬細胞（classically activated macrophage），啟動輔助性T 細胞（helper T cell，Th）1 型適應性免疫反應，分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6等促炎因子，以及C X C 趨化因子配體（C X C chemokine ligand，CXCL）1、CXCL9、CXCL10 等趨化因子，具有殺死微生物、清除感染等特性，促進組織炎癥和損傷[13]。當巨噬細胞在體外受到IL-4、I L-1 0 等刺激或真菌和蠕蟲感染時，可活化為M2 型，即替代活化型巨噬細胞（alternatively activated macrophage），誘導Th2 型免疫反應[14]，分泌IL-10、IL-18、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性蛋白等抗炎因子以及CC 趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL17、CCL22 等趨化因子，促進傷口愈合、纖維化形成。隨著單細胞RNA 測序技術的應用，發現巨噬細胞存在連續的極化狀態，而M1 型和M2 型是適應性反應中連續激活狀態的兩個極端，這種異質性表型的存在被解釋為巨噬細胞在不同刺激下的可塑性。

1.3 巨噬細胞在腎纖維化中的作用

腎纖維化是腎病進展到終末期的主要驅動因素[14-15]。巨噬細胞浸潤是腎缺血-再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，IRI）后的常見特征，近期研究表明，結節性硬化癥蛋白復合體1（tuberous sclerosis complex 1，TSC1）是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號通路的負調節因子，通過調節巨噬細胞的極化來影響IRI[16]。在IRI 早期，巨噬細胞中TSC1 缺陷可能導致M1 型巨噬細胞極化，加重腎功能障礙，而在IRI 修復過程中，TSC1 缺陷則減少M2型巨噬細胞極化，減輕腎纖維化。在單側輸尿管梗阻和IRI 模型中發現，造血細胞激酶（hematopoietic cell kinase，HCK）作為Src 家族激酶成員，通過抑制自噬誘導巨噬細胞活化推動腎纖維化[17]。在糖尿病腎病、IgA 腎病中也同樣發現巨噬細胞可能加速腎纖維化的發展[18-20]。

2 巨噬細胞-肌成纖維細胞轉分化

2.1 巨噬細胞-肌成纖維細胞轉分化的定義及特點

2014年Nikolic-Paterson 等[21]首次描述了來自骨髓的巨噬細胞可以直接轉分化為肌成纖維細胞，導致腎間質纖維化，這一過程被稱為MMT，發生轉分化的巨噬細胞被稱為MMT 細胞。MMT 細胞表現為巨噬細胞（CD68+或F4/80+）和肌成纖維細胞（α-SMA+）標記物共表達，并伴有細胞形態呈梭形改變。

一項研究活組織檢查（活檢）結果發現巨噬細胞（CD68+）和肌成纖維細胞（α-SMA+）標志物的共表達，且MMT 細胞在活動性纖維化病變中存在，但在無纖維化的急性炎癥或無纖維化病變的樣本中基本不存在，提示MMT 參與活動性腎纖維化[22]。同時該研究還通過譜系追蹤證實在腎纖維化的單側輸尿管梗阻動物模型中有大量α-SMA 和Ⅰ型膠原的F4/80+髓系巨噬細胞表達，提示發生MMT 的巨噬細胞為骨髓源性，且多數共表達CD206，提示發生MMT 的細胞以M2 型為主[22]。另一項同種異體移植腎慢性排斥反應損傷研究結果表明，在慢性排斥反應患者移植腎活檢標本中，MMT 細胞（CD68+/α-SMA+）約占肌成纖維細胞總數的50%，同樣，在接受Balb/c 腎移植的C57 BL/6J 小鼠中，MMT 細胞在慢性排斥反應的同種異體移植腎間質中構成了重要的細胞群體，提示MMT 與移植腎功能和間質纖維化的嚴重程度相關，會加速慢性腎移植損傷的間質纖維化[23]。阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征相關的腎病主要是由慢性間歇性缺氧引起的組織損傷。在慢性間歇性缺氧大鼠腎臟中觀察到鹽皮質激素受體激活，可能引起巨噬細胞浸潤和MMT，從而導致缺氧條件下腎纖維化[24]。但是依賴于標記物表達和譜系追蹤研究MMT 存在一定的局限性，研究專注于巨噬細胞的表型而不是功能。2018年一項研究解決了這個問題，該研究使用條件性敲除C D 4 5+白細胞中的Ⅰ型膠原（標記物Col1α1）小鼠，在單側輸尿管梗阻和腺嘌呤誘導的腎纖維化模型中，腎臟中沉積的Ⅰ型膠原38%～50%來源于骨髓源性細胞[25]。而在另一項研究中，骨髓源性肌成纖維細胞僅占腎臟中總肌成纖維細胞的10%左右[26]。因此，纖維化腎臟中發生MMT 的巨噬細胞來源還需更深入的研究。

在梗阻性腎病、移植腎慢性排斥反應、IgA 腎病、糖尿病腎病等多種腎臟病活檢組織中都發現有MMT 現象存在，提示MMT 是造成腎纖維化非常重要、普遍的因素[27-30]。MMT 是促進腎纖維化的一種機制，深入研究這一機制可能會發現腎纖維化的新的藥物治療靶點。

2.2 巨噬細胞-肌成纖維細胞轉分化的調控機制

目前，MMT 的調控機制并未明確，研究最多的是TGF-β1/Smad3 信號通路[31-33]。TGF-β 包含TGFβ1、TGF-β2和TGF-β33 種亞型，絕大多數的實質細胞都可以產生和分泌TGF-β，而一些浸潤細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、血小板等也可釋放TGF-β。TGFβ 的釋放和激活導致細胞外基質生成增多和降解減少，適量的激活可促進正常結構重塑和損傷修復，而過度的釋放則將導致器官和組織的纖維化。TGF-β 被認為是導致人類腎病中纖維化的關鍵因素。TGFβ1也是誘導M2 型巨噬細胞極化的主要因子，并促進纖維化腎臟中肌成纖維細胞的分化和積累，這在LeBleu 等[34]的研究中得到證實，該研究發現在α-SMA+細胞中條件性敲除Tgfbr2 基因（編碼TGF-β 受體Ⅱ）后，巨噬細胞浸潤減少，肌成纖維細胞的數量減少。值得注意的是，TGF-β1暴露的時間是決定體外細胞表型的一個重要因素。骨髓源性巨噬細胞短期（2 d）暴露于TGF-β1可誘導M2 型極化[35]，但持續的TGF-β1（5～7 d）激活，可誘導巨噬細胞向肌成纖維細胞轉分化[21-23]。

TGF-β 受體介導的信號通路中最重要的信號轉導分子是具有轉錄因子功能的Smad 蛋白，因而此通路稱為Smad通路。TGF-β/Smad被認為是調控MMT 促進腎組織纖維化的主要調節因子[36]。TGFβ 首先與細胞膜表面的TGF-β 受體Ⅱ結合，形成異二聚體復合物，然后再與TGF-β 受體Ⅰ結合形成四聚體，磷酸化TGF-β 受體Ⅱ近膜GS 區的絲氨酸/蘇氨酸殘基，使其活化?；罨腡GF-β 受體Ⅰ使受體相關性Smad2 和Smad3 磷酸化，后者與Smad4 形成三聚體復合物，復合物進入細胞核內并通過轉錄調節激活MMT 所需的基因。研究表明，將GFP+Smad3-/-或GFP+Smad3+/+骨髓源性巨噬細胞轉輸注到經輻射照射后的野生型單側輸尿管梗阻小鼠體內，受損腎臟內產生相同數量的GFP+巨噬細胞，但只有GFP+Smad3+/+巨噬細胞可轉分化為GFP+α-SMA+肌成纖維細胞，由巨噬細胞轉分化而來的肌成纖維細胞占肌成纖維細胞總數的60%以上，出現腎纖維化，且發生MMT 的巨噬細胞主要為M2 型；體外給予TGF-β1刺激骨髓源性巨噬細胞也可誘導MMT 反應，細胞變成長梭形并表達CD206、α-SMA 和Ⅰ型膠原，當Smad3 缺失，可以阻止M2 型巨噬細胞向MMT 細胞的轉分化和進行性腎纖維化，由此證明Smad3 是TGF-β1誘導MMT 和膠原生成所必需的[37]。在同種異體移植腎小鼠模型中，骨髓來源的M2 型巨噬細胞向肌成纖維細胞的轉分化也依賴Smad3 調節，敲除Smad3 后MMT細胞數量顯著減少，移植腎慢性纖維化程度減輕[23]。

腎纖維化中Smad3 途徑另一個確定的靶點是原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src。Src 是一種廣泛表達的非受體蛋白酪氨酸激酶，可被多種細胞表面受體觸發激活，包括免疫球蛋白受體、部分病原相關分子模式和損傷相關的分子模式受體、受體蛋白酪氨酸激酶、G 蛋白偶聯受體和細胞因子受體[38-39]。Src 的激活是腎間質成纖維細胞活化和腎纖維化形成的關鍵因素[40]。最近Tang 等[41]通過單細胞RNA 測序共鑒定了501 個與MMT 相關的差異表達基因，發現Src 位于TGF-β1誘導MMT 的差異表達基因網絡的中心，體外研究中TGF-β1在骨髓源性巨噬細胞中誘導MMT 需要Src，而染色質免疫沉淀表明TGF-β1觸發Smad3 結合到Src 的3'非翻譯區域以增加其轉錄，抑制Src 可以有效阻斷體內外MMT 的發生，從而抑制腎纖維化。Src 作為TGF-β1/Smad3 介導的MMT 的關鍵調控因子，揭示了MMT 可能的潛在機制。

近來另一項研究發現神經轉錄因子Pou4f1 在腎臟纖維化中也是Smad3 的直接靶點，是MMT 的關鍵下游調控因子[42]。在人類和實驗性腎病模型中，Pou4f1 的表達在體內腎纖維化早期和體外骨髓源性巨噬細胞發生MMT 期間達到峰值。依賴于Pou4f1的纖維化基因網絡，在轉錄水平上促進TGF-β1/Smad3 驅動的MMT。當巨噬細胞特異性沉默Pou4f1，可以有效阻止小鼠腎纖維化的進展。氯吡格雷是一種P2Y12 抑制劑，是一種新型的慢性腎病抗纖維化藥物，通過單細胞RNA 測序證明，P2Y12 在纖維化腎臟中由巨噬細胞高度表達，通過TGF-β1/Smad3 依賴性機制促進MMT 介導腎纖維化[43]。

3 小結與展望

綜上所述，以往的研究主要集中在巨噬細胞是如何通過間接機制推動腎纖維化的。近來通過譜系追蹤、單細胞測序、已知細胞類型標記物的共同表達和抑制MMT 的關鍵機制表明，在腎臟損傷修復過程中，巨噬細胞很可能通過MMT 直接參與腎纖維化形成。值得強調的是，支持MMT 存在的結論與細胞和組織中巨噬細胞和肌成纖維細胞屬性的共存以及研究模型中疾病的嚴重程度有關。為了更好地了解MMT的作用，還需要更好的分子表型來描述這些MMT 細胞的特征，以進一步研究調控MMT 的其他可能分子機制，為新的抗纖維化治療提供思路。