富含蛋白質濃稠猴頭菌乳的流變學及體外消化分析

蘇翠馨，魏世杰，常明昌,2，馮翠萍,2，曹謹玲,3，云少君,3，徐麗婧,3，耿雪冉,3，程菲兒,3，孟俊龍,2,*，程艷芬,3,*

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西農業大學 山西省食用菌工程技術研究中心，山西 晉中 030801；3.山西農業大學 山西省黃土高原食用菌重點實驗室，山西 晉中 030801）

猴頭菌（Hericium erinaceus，HE）又名猴頭菇、猴頭蘑等，隸屬于擔子門、傘菌綱、紅菇目、猴菇科、猴頭菌屬[1]，是一種藥食兩用菌，味道鮮美、營養豐富[2]，含蛋白質、多糖等生物活性物質[3]。Wang Mingxing等[4]在研究HE對胃的保護作用時發現，HE多糖可以減少胃黏膜病變和胃潰瘍的發生。馬強等[5]在研究HE多糖分子質量與養胃活性效果時發現，HE子實體多糖分子質量的降低有利于提高其抗炎活性，對胃黏膜細胞的損傷修復作用可以得到進一步發揮。Vigna等[6]發現口服HE有助于緩解睡眠障礙。這些生理功效使HE成為食品深加工及保健食品研發的重要原料。

世界上約8%的人口受吞咽困難的影響，其中，老年患者約為13%～38%，其中以中度吞咽困難患者為主[7]。吞咽困難會影響食物攝取和營養吸收，導致患者出現營養不良等并發癥[8]，嚴重時可能會導致死亡[9]。吞咽困難患者會出現一些生理變化，咀嚼能力下降和神經調節減慢，在吞咽食物時出現問題，如舌頭遞送食物的力量下降、會厭關閉氣管的時間延遲[10]。吞咽困難還可能引起其他不良反應，包括脫水、營養不良和社交焦慮[11]。這一問題的主要解決方法是通過添加增稠劑，制得呈蜂蜜狀的食物[12]，使吞咽更安全。增稠劑通常分為改性淀粉基和膠基兩類[13]，前者在過去廣泛使用，但后者因具有較好的適口性、質地和感官特征，最近越來越受歡迎[14]。但最常見的商品食用膠基增稠劑主要為黃原膠（xanthan gums，XG）、κ-卡拉膠（kappa carrageenan，KC）和羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose，CMC），且來源不同[13]。增加蛋白質的攝入量可減少肌肉減弱綜合癥（肌少癥）以及骨質疏松等疾病的發生，這在老年人中很常見[15]。2018年國際肌少癥臨床實踐指南建議對肌少癥的老年人患者進行蛋白質補充或增添富含蛋白質的飲食[16]。Li Chunlei等[17]研究表明補充乳清、大豆或乳清-大豆混合蛋白都可以保持老年人身體機能。Malafarina[18]和Helena[19]等研究表明蛋白質補充劑可以改善老年人的肌肉狀況。

本實驗以HE為原料，添加兩種蛋白質（乳清蛋白（whey protein，WP）或大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）），再分別添加3 種增稠劑（XG、KC或CMC）制備成富含蛋白質濃稠HE乳，研究其流動性和黏彈性以及體外消化特性。旨在為吞咽困難患者和老年人設計的食物提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

HE粉由山西農業大學食用菌團隊提供；牛奶購自當地超市。

WP 美國希爾瑪乳酪公司；SPI 臨沂山松生物制品有限公司；KC 滕州市香凝生物工程有限責任公司；XG 新疆梅花氨基酸有限公司；CMC 宜興通達化學有限公司；豬胃蛋白酶 美國Sigma公司；胰酶、膽汁酸鹽 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MCR102流變儀 安東帕（上海）商貿有限公司；64R高速冷凍臺式離心機 貝克曼庫爾特（美國）股份有限公司；UV-1100型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富含蛋白質濃稠HE乳的制備

HE粉與牛奶按照不同比例配制基礎HE乳（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g/mL））。蒸煮3 min，混勻，由10 名男性和10 名女性根據HE乳的氣味和口味等特征進行評分。將不同的蛋白質（WP或SPI）添加到基礎HE乳中，通過凱氏定氮法[20]測得HE乳總蛋白質量達到總質量的10%以上。并分別向富含蛋白質HE乳中添加KC、XG或CMC，然后將樣品攪拌均勻，并在4 ℃保存24 h。用流變儀測定表觀黏度（η）達到約蜂蜜狀（350～1 750 mPa·s）。將50 s-1的剪切速率作為評估表觀黏度確保安全吞咽的標準[21-22]。

1.3.2 HE乳流動黏彈性的表征

用流變儀進行測定，椎板PP 50、間隙1 mm、溫度37 ℃、剪切速率0.01～100 s-1，上樣后等待180 s，在幾何形狀的外部添加硅油防止樣品干燥。

1.3.2.1 穩態流變實驗

按照1.3.2節描述的方法，進行樣品的穩態流動行為測定。

1.3.2.2 黏彈性測試

通過應力掃描測試確定HE乳的線性黏彈性區域（linear viscoelastic region，LVR）。測試條件：剪切應變范圍0.1%～100%，角頻率0.1～100 rad/s。在LVR內，進行頻率掃描測試，測定條件：間距1 mm；溫度37 ℃；上樣后等待180 s；頻率1 Hz；應變1%；角頻率掃描范圍0.1～100 rad/s。溫度掃描測試：間距1 mm；上樣后等待180 s；頻率1 Hz；應變1%；溫度掃描范圍15～80 ℃；掃描速率10 ℃/min。測定不同條件對HE乳的彈性模量（G′）、黏性模量（G″）、損耗系數（tanδ）、凝膠性能參數以及黏彈性參數的影響。

1.3.3 體外模擬唾液、胃和小腸消化

分別收集在2 h內未進食的健康的5 名男性和5 名女性的唾液，將新鮮唾液充分混勻，4 400×g離心10 min，取上清液，配制0.1 g/mL的HE乳溶液，將唾液上清液與HE乳充分混勻，37 ℃孵育4 h，沸水浴5 min，使唾液中的淀粉酶失活。

將10 mL唾液消化殘液與4.0 mL的人工模擬胃液混勻，調pH值至3.0，37 ℃孵育6 h。孵育完成后，取適量消化液，沸水浴5 min，收集備用。人工模擬胃液由3.6 mL的胃電解質液（0.053 mol/L NaCl、0.15 mol/L KCl、0.001 mol/L CaCl2·2H2O和0.007 mol/L NaHCO3）和胃蛋白酶溶液（30 mg胃蛋白酶溶解于1 mL的1 mol/L CH3COONa中）組成。

將10 mL胃消化殘液與4.0 mL模擬小腸液混勻。調pH值至7.0，37 ℃孵育6 h。孵育完成后，取適量消化液，收集備用。模擬小腸液由2.0 mL小腸電解質液（0.092 mol/L NaCl、0.009 mol/L KCl、0.002 mol/L CaCl2·2H2O）、1.0 mL胰酶溶液（1.25 g胰酶溶于5 mL蒸餾水）和1.0 mL膽汁鹽溶液（4 g膽汁酸鹽溶于100 mL蒸餾水）組成[23]。

1.3.3.1 消化HE乳的流動流變行為分析

利用上述消化過程，按照1.3.2節方法，對消化樣品的流動流變性能進行測定，采用同軸圓筒（CP25/1°），測定η、流動系數（n）、稠度系數（K）、決定系數（R2）等參數。在10 s-1時（剪切速率接近生理學報道的值[24]）測量η值。

1.3.3.2 HE乳蛋白質消化率的測定

對消化前和模擬體外消化后獲得HE乳的蛋白質消化率進行評估。測定總可溶性蛋白含量（Bradford法）、可溶性肽含量（三氯乙酸法）和游離氨基酸含量（雙指示劑甲醛滴定法）。所有實驗均重復3 次。

1.4 數據分析

結果由SPSS軟件進行統計處理。數據采用單因素方差分析，均數比較采用Tukey-Kramer HSD檢驗。用不同字母表示結果有顯著差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 富含蛋白質濃稠HE乳的制備

由圖1a所示，當料液比為1∶60時，基礎HE乳的風味評分最高，為90 分，HE具有淡淡的香味，無苦味。如圖1b所示，隨著蛋白質添加量的增加，SPI和WP質量分數增加，其中對照組最低，分別為1.947 6%和2.611 6%，當蛋白質添加量為10%時，SPI和WP質量分數高達25.986 8%和30.984 4%。按照膳食營養素參考攝入量標準[25]，推薦65 歲及以上老年人蛋白質攝入量為：男65 g/d，女55 g/d，故選用SPI和WP的添加量均為10%。

圖1 HE乳的制備Fig.1 Preparation conditions of HE incorporated milk

根據李敏等[12]研究糊狀飲食對中度吞咽障礙老年患者營養狀態及吞咽功能的影響表明，使食物的黏度達到蜂蜜狀（351～1 750 mPa·s）有助于中度吞咽困難的患者食用。樣品在37 ℃、剪切速率為50 s-1、表觀黏度為蜂蜜狀（351～1 750 mPa·s）時，確定增稠劑的質量分數如表1所示。

表1 HE乳增稠劑的含量及表觀黏度Table 1 Effect of thickener type and concentrations on apparent viscosity of HE incorporated milk

2.2 HE乳的流動特性和黏彈性

2.2.1 HE的流動特性

用流變儀測定HE乳的穩態流動特性，使用Herschel-Bulkley模型擬合流變參數。由表2所示，屈服應力（δ0）是樣品開始流動所需的最小剪切應力，與其內部結構的破壞有關[26]。不同樣品的δ0不同，歸因于不同體系的緊密堆積，這是由于增稠劑提高了食物顆粒之間的凝聚力[27]。添加XG的HE乳在2 種蛋白質中都具有δ0，更有利于吞咽困難的人食用。不同HE乳的K值不同，其中HESPI-KC的K值最高，為819.55 Pa·s，HE-WP-KC的K值最低，為6.72 Pa·s。此外，所有HE乳的n值均小于1，表明它們在超過δ0后表現出剪切變稀的流動特性；n＜1的食物有利于吞咽[28]。這與Vieira等[24]為有吞咽問題的人設計不同增稠劑溶液的研究中觀察到的結果一致。

表2 在37 ℃ HE乳穩定流動的流變參數Table 2 Steady rheological parameters of HE incorporated milk at 37 ℃

2.2.2 HE乳的黏彈性

圖2顯示了37 ℃ HE乳的G′、G″和tanδ值隨頻率的變化。在0.1～100 rad/s內，所有樣品的G′＞G″，這表明樣品為弱凝膠。tanδ＞1表示稀溶液，而在0.1～1之間表示弱凝膠[29]。所有樣品的tanδ均在0.22～0.56之間，進一步證實了它們具有弱凝膠特性。這與Ribes等[30]的研究結果一致。

圖2 不同HE乳的頻率掃描Fig.2 Frequency scanning of HE incorporated milk

通過計算對數變化下HE乳的G′和G″斜率（分別為n′和n″）與頻率的關系，進一步了解頻率對G′和G″值的影響。用G0′-G0″值衡量凝膠強度，復模量（G*）與樣品的剛度和硬度有關，而復合黏度（η*）是基于角頻率評估產品的整體流動阻力[31]。在37 ℃、頻率1 Hz條件下進行頻率掃描，結果如表3所示。所有HE乳的n′和n″值都在0～1之間，表現為弱凝膠行為。HE乳的n″＞n′，表明G″比G′更依賴頻率。這與Alvarez等[32]在海鱸魚蔬菜泥和雞肉蔬菜泥中描述的結論一致。HE-SPI-CMC的G0′-G0″值最高，這是由于帶負電荷的羧基與蛋白質的陽離子結構域相互作用，使CMC形成強的網絡結構，增加凝膠強度[33]。所有HE乳都表現出彈性行為（G′＞G″），這與Ribes[30]和Herranz[34]等的研究結果一致。HE-SPI-CMC的G*和η*值最高，因為這是增稠劑的陰離子結構域（帶負電荷的羧基）和蛋白質的陽離子結構域（氨基酸）之間形成了強網絡，從而加強了HE乳的結構[35]。所有HE乳的tanδ值均小于1，表明其具有彈性特性。Nystr?m等[35]指出高彈性的稀液體有利于吞咽困難的人食用。同樣，Ishihara等[36]認為tanδ值在0.1～1之間可以作為易吞咽的流變學標準。因此，考慮到具有高抗變形性（高G*值）和良好彈性（低tanδ值）的食品吞咽更安全[37]，認為HESPI-XG、HE-SPI-CMC、HE-WP-XG、HE-WP-CMC和HE-WP-KC更適合吞咽障礙人群食用。

表3 HE乳的凝膠性能參數和黏彈性參數Table 3 Gel properties and viscoelastic parameters of HE incorporated milk

為了確定溫度對樣品結構變化的影響，從15～80 ℃進行溫度掃描實驗，如圖3a、b所示，隨著溫度的升高，各樣品G′和G″值基本都在減小。因為需要更多的熱能克服螺旋內部鏈分子內和分子間鍵的能量。但當溫度高于50 ℃時，HE-WP-XG的G′和G″增加，這是因為溫度升高，HE乳中WP分子鏈與XG分子運動更加劇烈，又伴隨著WP的變性，XG與WP相互作用增強，說明增稠的WP與XG具有強的物理糾纏網絡結構，增稠的效果最好，從而加大了HE乳G′和G″值上升的趨勢[38]。這與顏準等[39]研究溶液環境對吞咽障礙食品膠基增稠劑流變學性質的影響結果一致。如圖3c所示，所有HE乳的tanδ值都在0.1～1，表明其具有良好彈性，有利于吞咽困難的人食用[40]。

圖3 15～80 ℃不同HE乳的溫度掃描結果Fig.3 Temperature scanning results of HE incorporated milk at 15-80 ℃

2.3 消化HE乳的流動流變特性

測定在體外胃腸消化過程中消化HE乳的流變特性參數η（10 s-1）、n、K和R2，結果見表4。所有HE乳基本表現出非牛頓剪切變稀行為（n＜1）。相比其他消化部位，口腔中η值最高。消化后的樣品中，HE-WP-KC的η值和K值最高（分別為528.160 mPa·s和5.823 Pa·s），其次是HE-WP-XG和HE-SPI-XG，表明這些樣品的結構受口腔α-淀粉酶的影響較小。HE-WP-KC在口腔和胃相的η和K參數差異最大，這可能是由于α-淀粉酶和胃蛋白酶的作用，WP的水解程度最高。腸消化階段結束后，消化樣品的η值和K值基本無顯著差異（P＞0.05）。這與Ribes等[30]的研究結果相似。

表4 HE乳在體外胃腸消化過程中的流動流變行為參數Table 4 Rheological parameters of HE incorporated milk during in vitro gastrointestinal digestion

2.4 HE乳蛋白質消化率

通過測定消化期間HE乳的可溶性蛋白質、可溶性肽和游離氨基酸的含量評估HE乳的消化特性。如圖4a所示，消化前，WP可溶性蛋白含量高于SPI，不同樣品的含量在不同的消化階段呈下降趨勢。在消化后，添加不同增稠劑的HE乳可溶性蛋白含量基本無顯著差異（P＞0.05），與樣品的蛋白種類無關，這是因為α-淀粉酶的相互作用導致蛋白質沉淀或聚集，這一階段不會發生蛋白質水解[41]。如圖4b所示，與消化前相比，每個消化階段HE乳多肽含量都在增加，尤其是在胃消化階段，HE-SPI-CMC增長最高，為1.413 2 mg/g，HE-WP-KC含量（1.171 8 mg/g）次之，在胃蛋白酶的作用下，使得HE乳更容易消化。在胃消化階段，HE-SPI-XG和HE-WPXG沒有顯著差異（P＞0.05）。消化完成后，HE-WP-KC的多肽含量高達1.491 8 mg/g，證明腸道酶（主要是胰蛋白酶）在水解蛋白質并生成肽和游離氨基酸方面發揮了關鍵作用。如圖4c所示，在口腔消化階段HE-WP-KC和HE-WP-CMC游離氨基酸含量無顯著差異（P＞0.05）。消化完成后，WP的游離氨基酸含量高于SPI，表明添加WP的HE乳更易于人體消化和吸收。其中，HE-SPI-XG樣品的游離氨基酸質量分數最低，為0.029 2%；HE-WPCMC最高，為0.034 1%，其次是HE-WP-KC、HE-SPIKC和HE-WP-XG。

圖4 HE乳的蛋白質消化率Fig.4 Protein digestibility of HE incorporated milk

這些結果表明，雖然所有HE乳的初始蛋白質量分數都高達10%，但蛋白質消化率會受到樣品組成、結構組織和理化性質的影響，這是由于添加的蛋白質及增稠劑與食物基質的相互作用[41]。蛋白質-增稠劑的相互作用取決于化合物的結構、組成、pH值、離子強度、電離度、電荷密度等[42]，并可通過增加或減少消化酶的作用影響食物消化。據報道，陰離子多糖如KC、XG可以減少胃腸消化期間牛奶、雞蛋或大豆蛋白的分解，而海藻酸鹽減少了胃消化期間的蛋白質水解[43]，但沒有減少小腸消化期間的蛋白質水解[44]。

3 結論

富含蛋白質濃稠HE乳表現出剪切變稀的流動行為；HE-SPI-XG、HE-SPI-CMC、HE-WP-XG、HE-WP-CMC和HE-WP-KC具有高抗變形性和良好的彈性，更適合吞咽困難患者和老年人食用；在模擬體外消化實驗中，HESPI-XG、HE-WP-XG和HE-WP-KC有較高的黏度和稠度，有利于老年人和吞咽困難的人食用；通過測定HE乳蛋白質的消化率，可知WP蛋白質含量高于SPI；HE-WPCMC和HE-WP-KC在消化完成后游離氨基酸的含量最高。本研究證實了添加蛋白質和增稠劑與食物基質之間的相互作用決定了樣品的流變學特性和消化特性。綜上所述，在設計適合吞咽困難或老年人的食品時，以WP為蛋白質源和KC為增稠劑制備食品是一個很好的選擇。