血必凈注射液對心臟驟停/心肺復蘇后大鼠神經功能及生存情況的影響機制 Δ

黃德慶 ，高玉廣 張元侃 王政林 鄧海霞 黃夏冰 龐 延 吳 林 （.廣西中醫藥大學第一附屬醫院急診科，南寧 53003；.廣西中醫藥大學科學實驗中心，南寧 53000）

心臟驟停（cardiac arrest，CA）是全球患者主要的死亡原因之一，是嚴重的公共衛生問題[1]。隨著心肺復蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）技術的不斷發展和進步，CA患者初期恢復自主循環的比例有所提高，但其總生存率并未得到明顯改善，且大部分幸存者會出現中、重度神經功能缺損及認知功能障礙，甚至處于植物人狀態，給其家庭及社會造成嚴重的疾病負擔。雖然目標溫度管理、體外循環支持等技術對CA/CPR 患者腦損傷有益，但臨床尚缺乏效果可靠的治療措施[2―3]。因此，挖掘CA/CPR 后腦保護的治療靶點和有效干預措施顯得尤為重要。

近年來，中醫藥用于CA救治取得了較好的效果，其中中藥制劑——血必凈注射液應用廣泛[4]。該注射液由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸5 味中藥組成，能改善CA/CPR后患者的器官功能，并降低其死亡率[5―6]，但具體機制尚未明確。S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是人體內含量豐富的亞硝基硫醇之一，也是重要生物活性物質一氧化氮（NO）的供體，能阻斷腦缺血/再灌注動物模型的炎癥反應和繼發性腦損傷；同時，GSNO能控制NO 持續少量釋放，對CA/CPR 致腦損傷具有改善作用[7]。GSNO的含量受S-亞硝基谷胱甘肽還原酶（Snitrosoglutathione reductase，GSNOR）的調節。近期研究結果表明，抑制CA/CPR后小鼠腦內GSNOR的表達，能夠提高其腦內GSNO含量并改善其相關癥狀[8]。學者在其他病種的研究中發現，血必凈注射液能夠增加誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的含量，提示該藥的藥理作用與其調節NO 生物活性有關[9]。因此，本研究擬從GSNOR/GSNO 途徑出發，采用高通量測序聯合酶聯免疫吸附測定（ELISA）驗證該途徑在CA/CPR大鼠體內的表達情況，并對血必凈注射液主要活性成分與GSNOR 進行分子對接；同時，擬以GSNOR特異性抑制劑SPL-334.1為參照，觀察血必凈注射液對大鼠GSNOR、GSNO 表達的影響，以期明確血必凈注射液對CA/CPR 大鼠神經功能及生存情況影響的潛在機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ELX808型多功能酶標儀（美國BioTek 公司），CDS9000 型小動物麻醉機（美國SurgiVet 公司），ThermoMixer C 型恒溫儀（德國Eppendorf 公司），HPMS 型動物監護儀、定制小動物手術操作系統（美國Harvard公司），NovaSeq 6000型測序系統（美國Illumina公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

血必凈注射液（批號2303031，每支10 mL）購自天津紅日藥業股份有限公司；SPL-334.1 原料藥（貨號T28837）購自上海吉凱基因醫學科技股份有限公司；GSNOR、GSNO ELISA 檢測試劑盒（貨號分別為XEY-35884、FT-101490E）均購自上海梵態生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

清潔級SD 大鼠160 只，雄性81 只、雌性79 只，體重（200±20）g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（湘）2019-0014。本動物實驗方案經廣西中醫藥大學實驗動物福利倫理委員會審核（批準編號DW20201011-77），符合實驗動物福利倫理的相關規定。

2 方法

2.1 模型制備

大鼠禁食不禁水12 h，稱重后，腹腔注射3%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉，固定于小動物實驗臺上，行氣管插管并實時監測，記錄其呼氣末二氧化碳分壓；于大鼠右側股動脈置入PE50管（深度約6 cm），行血壓實時監測；以肛溫表監測大鼠體溫，并使其體溫維持在（37.0±0.5）℃；將二導聯心電儀電極刺于大鼠皮下，實時監測和記錄其心電活動情況。分離大鼠右側頸外靜脈，置入絕緣導管（深度約4 cm），按本課題組前期研究及相關文獻[10]方法制備CA/CPR模型：測得大鼠基礎狀態數據后，于誘顫前先行呼吸機通氣5 min（潮氣量為6 mL/kg，吸入氧濃度為21%，通氣頻率為100次/min）；通氣結束后，于大鼠右側頸外靜脈絕緣導管中插入金屬導絲，通電（2 mA）誘顫，密切觀察大鼠心電圖及血壓情況，及時調整誘顫電流大小及導絲位置，直至大鼠出現室顫心律；誘顫2.5～3 min后，關閉電源，大鼠呈自發室顫（自誘顫心電呈現室顫心電波形開始，持續室顫6 min）。術中，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥10 mg/（kg·h）行麻醉維持。室顫大鼠在心臟停搏5.5 min時，行呼吸機通氣（吸入氧濃度為100%，通氣頻率為200次/min）；于心臟停搏6 min 時，予胸外按壓（按壓頻率200 次/min，按壓深度1 cm，按壓部位為劍突上2.8 cm）進行復蘇，以平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）≥60 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）持續5 min視為自主循環恢復[室顫大鼠于按壓心臟5 min 后行電擊除顫，如除顫后自主循環不能恢復，需靜脈注射腎上腺素（每次0.1 mg）；持續按壓心臟20 min，除顫3次，自主循環仍不能恢復者，視為復蘇失敗]。

2.2 差異表達基因檢測與驗證

取大鼠按“2.1”項下方法造模，作為模型組；另取大鼠只分離右側頸外靜脈并置管而不進行CA/CPR操作，作為假手術組（下同）。取模型組和假手術組大鼠各5只（雄性3只、雌性2只），腹腔注射3%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉后處死，提取其雙側海馬組織（55～65 mg），研磨成漿，使用TRizol 液提取RNA，檢測純度和濃度后，制備RNA 文庫；參考Illumina DNA Prep 文庫制備自動化工作流程，以測序系統測序，剔除低質量的基因并篩除不表達的基因并作標準化處理后，運用DRAGEN Germline Pipeline軟件對2組樣本的測序數據進行分析，以假手術組為對照，以|log2FC|≥1[FC 為表達量差異倍數（fold change）]、P＜0.05 為標準[11]，借助火山圖篩選差異表達基因并確定GSNOR 是否在其中，同時進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。隨后，參照相應試劑盒說明書，采用ELISA法以酶標儀檢測2組大鼠海馬組織中的GSNOR、GSNO 含量，以驗證差異表達基因的分析結果。

2.3 血必凈注射液活性成分篩選

在中藥系統藥理數據庫與分析平臺[Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），http：//tcmspw.com/tcmsp.php]和中藥綜合數據庫[Traditional Chinese Medicine Integrated Database（TCMID），http：//119.3.41.228：8000/tcmid/]中搜索血必凈注射液組方藥材（紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸）所含成分，并運用TCMSP自帶的“ADME（absorption，distribution，metabolism，excretion）”篩選功能，以血腦屏障透過率（blood-brain barrier，BBB）≥－0.3、藥物相似性評分（drug-likeness weight，DW）＞0.6為標準[12―13]，篩選度值（degree）排前10位的活性成分。

2.4 血必凈注射液活性成分與GSNOR的分子對接驗證

從TCMSP、TCMID 數據庫中獲取各活性成分結構的“mol2”格式；運用PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org）檢索成分對應靶點的蛋白構象，使用PyMOL 軟件對蛋白進行脫水處理后以“pdb”格式導出；利用AutoDock軟件對血必凈注射液活性成分與GSNOR 蛋白（PDB 編號3qj52）進行分子對接，評估結合能后使用PyMOL 軟件對最優對接結構[結合能越低，結合活性越強；若結合能≤－6 kcal/mol（1 kcal＝4.186 kJ）則表明分子間具有較強的結合活性[14]]進行可視化展示。

2.5 動物實驗驗證

2.5.1 分組、造模與給藥

取大鼠按“2.1”項下方法造模，將造模成功的大鼠分為模型組、抑制劑組、血必凈組、血必凈+抑制劑組，并設置假手術組，每組30只，雌雄各半。假手術組和模型組大鼠于術后通過頸外靜脈注射與血必凈組等體積的生理鹽水；抑制劑組大鼠于術后通過頸外靜脈注射6 mg/kg的SPL-334.1（以生理鹽水為溶劑，劑量參考相關文獻[8]設置）；血必凈組大鼠于術后通過頸外靜脈注射4 mL/kg的血必凈注射液（劑量參考相關文獻[15]設置）；血必凈+抑制劑組大鼠于術后通過頸外靜脈先后注射SPL-334.1和血必凈注射液（劑量同各單藥組）；每天2次，連續3 d。

2.5.2 取材

分別于藥物首次干預后3 h、24 h、3 d 時，從各組中選取大鼠10 只，腹腔注射3%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉后處死；以仰臥位將四肢固定于解剖板上，開胸后充分暴露心臟，將灌注針頭插入左心室，剪開右心耳，同時快速灌注生理鹽水100 mL；灌注完畢后于冰上斷頭取腦，用生理鹽水沖去多余血液，在大腦中下1/3 交界處完整剝離雙側海馬，迅速放入－80 ℃冰箱中保存，備檢。

2.5.3 大鼠神經功能評分及生存情況記錄

分別于“2.5.2”項下取材前對各組大鼠進行神經功能評分及生存情況記錄。神經功能評分采用改良的神經系統損害嚴重程度評分表（modified neurologic severity scale，mNSS）：該表總分為18 分，其中0 分為正常、1～6分為輕度損害、7～12分為中度損害、13～18分為重度損害[16]。大鼠生存情況采用Cox 回歸分析：使用R 語言的“survival”包進行比例風險假設檢驗，同時進行生存回歸擬合并繪制生存率曲線，使用“survminer”包和“ggplot2”包進行可視化展示。

2.5.4 海馬組織中GSNOR、GSNO含量檢測

取“2.5.2”項下各時間點各組大鼠的雙側海馬組織適量，參照相應試劑盒說明書，采用ELISA 法以酶標儀檢測其中GSNOR、GSNO含量。

2.5.5 GSNOR、GSNO含量與mNSS評分相關性評價

運用Pearson 法分析GSNOR、GSNO 含量與大鼠mNSS評分的相關性。

2.6 統計學方法

采用Excel 軟件錄入數據，SPSS 19.0 軟件進行統計分析。符合正態分布且方差齊的計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態分布或方差不齊的計量資料以中位數和四分位間距表示，組間比較采用U檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 差異表達基因篩選及驗證結果

經對比模型組與假手術組大鼠雙側海馬組織的測序結果發現，GSNOR 編碼基因在差異表達基因中（圖1A）；PCA分析結果顯示，假手術組和模型組大鼠樣本的離散程度高，兩者存在明顯差異（圖1B）；進一步的ELISA 檢測結果顯示，模型組大鼠海馬組織中GSNOR含量顯著高于假手術組，GSNO含量顯著低于假手術組（P＜0.01，圖1C）。

3.2 血必凈注射液活性成分篩選結果

根據“2.3”項下標準，本研究最終篩選出degree排前10 位的活性成分，包括木犀草素、異歐前胡素等，具體見表1。

表1 血必凈注射液中degree排前10位的活性成分

3.3 分子對接驗證結果

異歐前胡素、去甲丹參酮、鼠尾草酚酮、豆甾醇與GSNOR 具有較強的結合活性，結合能分別為－8.0、－9.2、－8.5、－8.1 kcal/mol，以氫鍵連接為主。結果見圖2（以去甲丹參酮、鼠尾草酚酮為例）。

圖2 血必凈注射液活性成分與GSNOR的分子對接圖

3.4 動物實驗驗證結果

3.4.1 大鼠神經功能和生存情況

首次給藥后3 h、24 h、3 d時，假手術組大鼠的mNSS評分均為0 分；模型組大鼠各時間點的mNSS 評分均顯著高于同期假手術組（P＜0.05），且有隨時間延長而逐漸降低的趨勢；血必凈組、抑制劑組、血必凈+抑制劑組大鼠的mNSS評分均顯著低于同期模型組（P＜0.05），且血必凈組顯著低于同期抑制劑組，血必凈+抑制劑組顯著低于同期血必凈組及抑制劑組（P＜0.05）。結果見表2。

表2 不同時間點各組大鼠mNSS 評分比較（±s，n＝10，分）

表2 不同時間點各組大鼠mNSS 評分比較（±s，n＝10，分）

組別假手術組模型組抑制劑組血必凈組血必凈+抑制劑組給藥后3 h 0 7.05±0.80a 5.90±0.45b 5.21±0.36bc 4.29±0.82bcd給藥后24 h 0 4.46±0.30a 4.31±0.24b 2.86±0.41bc 1.88±0.47bcd給藥后3 d 0 3.84±0.75a 2.98±0.58b 2.12±0.62bc 1.17±0.16bcd

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與抑制劑組比較，P＜0.05；d：與血必凈組比較，P＜0.05。

假手術組沒有大鼠死亡，模型組在給藥后3 h、24 h、3 d時分別有1、3、7只大鼠死亡，共死亡11只；血必凈組在上述時間點分別有1、1、2只大鼠死亡，共死亡4只；抑制劑組在上述時間點分別有1、2、3只大鼠死亡，共死亡6只；血必凈+抑制劑組僅在首次給藥后24 h時有1只大鼠死亡。各組大鼠的生存率曲線見圖3。

圖3 各組大鼠的生存率曲線

3.4.2 大鼠海馬組織中GSNOR、GSNO含量

給藥后3 h、24 h、3 d 時，模型組大鼠海馬組織中GSNOR 含量均較同期假手術組顯著升高，GSNO 含量均較同期假手術組顯著降低（P＜0.05）；血必凈組、抑制劑組、血必凈+抑制劑組大鼠海馬組織中GSNOR含量均較同期模型組顯著降低，GSNO含量均較同期模型組顯著升高（P＜0.05），且抑制劑組較同期血必凈組、血必凈+抑制劑組較同期血必凈組及抑制劑組的變化更明顯（P＜0.05）。結果見表3。

表3 不同時間點各組大鼠海馬組織中GSNOR、GSNO含量比較（±s，n＝10，pg/mg）

表3 不同時間點各組大鼠海馬組織中GSNOR、GSNO含量比較（±s，n＝10，pg/mg）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與抑制劑組比較，P＜0.05；d：與血必凈組比較，P＜0.05。

組別假手術組模型組抑制劑組血必凈組血必凈+抑制劑組GSNOR 3 h 0.10±0.02 1.11±0.26a 0.81±0.17b 0.94±0.07bc 0.64±0.13bcd 24 h 0.10±0.02 0.80±0.15a 0.43±0.07b 0.63±0.12bc 0.37±0.08bcd 3 d 0.09±0.02 0.56±0.02a 0.33±0.06b 0.45±0.13bc 0.23±0.07bcd GSNO 3 h 2.31±0.11 0.50±0.02a 0.80±0.01b 0.73±0.04bc 0.98±0.02bcd 24 h 2.33±0.09 0.73±0.20a 1.25±0.05b 1.14±0.14bc 1.38±0.24bcd 3 d 2.30±0.09 1.07±0.11a 1.56±0.33b 1.23±0.22bc 2.23±0.31bcd

3.4.3 GSNOR、GSNO含量與mNSS評分的相關性

GSNOR 含量與大鼠mNSS 評分呈正相關（r＝0.962，P＜0.001），而GSNO 含量與大鼠mNSS 評分呈負相關（r＝－0.914，P＜0.001）。結果見圖4。

圖4 大鼠海馬組織中GSNOR、GSNO含量與其mNSS評分的相關性分析

4 討論

CA/CPR 是一個復雜的病理生理過程，全腦缺血性損傷是患者最主要的死亡原因[2―3]，但目前該損傷的發生機制尚未明確，故探索相關機制并尋找潛在治療靶點和有效干預措施具有重要的臨床意義。

本研究通過高通量測序分析及ELISA 實驗發現，GSNOR編碼基因是假手術組和模型組大鼠海馬組織樣本的差異表達基因之一；CA/CPR 后，大鼠海馬組織中GSNOR 含量明顯升高，而GSNO 含量則明顯降低。研究指出，GSNO對CA/CPR后的腦損傷具有保護作用，其機制與控制體內NO 持續少量釋放有關[7]；同時，GSNO的含量受GSNOR的調節，GSNOR可通過降解GSNO而減弱GSNO 的腦保護作用[17]。由此可見，抑制GSNOR表達從而增加體內GSNO 含量，對CA/CPR 后缺血性腦損傷具有改善作用，GSNOR/GSNO 途徑可能成為CA/CPR治療的潛在途徑。本研究分子對接結果提示，血必凈注射液的活性成分——異歐前胡素、去甲丹參酮、鼠尾草酚酮、豆甾醇與GSNOR有較強的結合活性，提示血必凈注射液腦保護作用的發揮可能是通過調控GSNOR的表達而實現的。

基于以上2 項研究結果，本課題組進一步采用動物實驗進行驗證。結果顯示，大鼠CA/CPR 后，除假手術組外，其余各組大鼠均出現了不同程度的神經功能損傷，并可見GSNOR含量升高、GSNO含量降低。經藥物干預后，抑制劑組、血必凈組、血必凈+抑制劑組大鼠各評估時間點的神經功能均有明顯改善，生存率明顯升高，且GSNOR含量顯著低于同期模型組，GSNO含量顯著高于同期模型組，提示血必凈注射液可抑制GSNOR表達，從而提高體內GSNO 含量并改善CA/CPR 大鼠神經功能，與既往研究結果[7]基本一致。但值得注意的是，既往研究采用的是高鉀法建立CA/CPR 模型[7]，高鉀法操作相對簡單，但所建動物模型可能出現無脈性心電活動或心室靜止，和臨床上成人CA 初始心律多表現為室顫不符；同時，由于注射氯化鉀可引起動物電解質紊亂，故還需進一步考慮電解質紊亂對實驗結果的影響。而本研究所用的室顫法是建立CA/CPR 模型的常規方法，由于臨床大部分CA 是由室顫引起，故此法所得模型更接近于臨床成人CA的病理特點[8，18]。

血必凈注射液具有活血化瘀、舒通絡脈、潰散毒邪的功效，被廣泛用于重癥肺炎、重癥急性胰腺炎、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥等危重疾病的臨床治療[19]。血必凈注射液所主治瘀毒互結證的中醫病機與CA/CPR患者缺血、缺血/再灌注損傷及全身炎癥反應的病理改變相符，故該藥已被廣泛用于CA/CPR后的治療[4]。本研究結果顯示，血必凈組大鼠海馬組織中GSNOR 含量顯著低于模型組，而GSNO 含量顯著高于模型組，提示血必凈注射液能夠抑制GSNOR的表達，進而提高GSNO 含量，從而改善CA/CPR 后大鼠的神經功能并提高其生存率。

本研究還發現，血必凈注射液聯合GSNOR 抑制劑對大鼠神經功能及生存率的改善效果顯著優于單用血必凈注射液或單用GSNOR抑制劑，提示聯合GSNOR抑制劑能明顯提高血必凈注射液對大鼠CA/CPR 后腦損傷的干預效果，可為未來的藥物研發提供線索。值得注意的是，本研究還發現，抑制劑組大鼠各時間點的GSNOR 含量均顯著低于血必凈組，GSNO 含量均顯著高于血必凈組，而各評估時間點的神經功能及生存率均不及血必凈組，提示血必凈注射液改善CA/CPR 后大鼠神經功能、生存率的作用可能依賴于GSNOR/GSNO 途徑，但同時可能涉及其他分子機制，具體情況尚需進一步實驗驗證。

綜上所述，血必凈注射液能夠改善大鼠CA/CPR 后的神經功能并提高其生存率，其作用與下調GSNOR 并上調GSNO 有關。但血必凈注射液這一作用是否還與其他信號通路有關尚需進一步探討。