miR-145通過Notch通路調節免疫功能及炎癥反應介導創傷性腦損傷的神經保護

胡德獻 孫衍昶 馮基高 莫業和 （海南醫學院第二附屬醫院神經外科，?？?570311）

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是死亡和殘疾的最常見原因之一，給世界各地的患者帶來巨大的心理和經濟負擔［1］。TBI包括原發性和繼發性腦損傷，繼發性損傷包括細胞凋亡、氧化應激、免疫反應和炎癥的復雜級聯反應［2］。據報道，神經炎癥是繼發性腦損傷的關鍵因素，大腦中的炎癥反應通常涉及大量神經元壞死或死亡以及小膠質細胞激活［3］。既往研究表明，中度或重度創傷性腦損傷誘發慢性小膠質細胞激活，其可能是延遲細胞死亡和組織損傷的結果［4］。最近的研究表明，調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）在一些疾病中調節免疫和炎癥，如腦缺血、病毒性心肌炎和重癥肌無力［5-7］。然而，其潛在的病理和生理機制仍不清楚。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類小的非編碼核糖核酸，通過與特定靶標mRNA的3'-非翻譯區（3'-UTR）結合來負調控基因表達，從而抑制mRNA翻譯或直接降解mRNA。據報道，多種微小核糖核酸的異常表達與TBI的發展有關。miR-145是最豐富和高度保守的miRNAs之一，與巨噬細胞極化有關［8］。研究表明，過表達miR-145可能通過抑制小膠質細胞活化預防缺血性腦卒中［9］。免疫/炎癥反應在繼發性腦損傷的病理過程中發揮重要作用，但miR-145在TBI后免疫/炎癥反應調節中的作用尚不清楚。因此，本研究將探討miR-145對神經預后的影響及其與神經炎癥和免疫反應的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 BCA試劑盒、ELISA試劑盒（上海碧云天公司）；抗Notch1、p21、Hes1、NeuN抗體（Abcam公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；流式細胞儀染色緩沖液（上海賓智生物科技有限公司）；miR-145 agomir、NC agomir（上海捷瑞生物工程有限公司）；TUNEL試劑［羅氏診斷產品（上海）有限公司］。動物立體定位儀（上海軟隆科技發展有限公司）；顯微鏡（Olympus公司）；酶標儀（Thermo Fisher公司）；熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.1.2 實驗動物 8～10周齡雄性C57BL/6小鼠購于海南藥物研究所有限責任公司，體質量21～23 g，生產許可證號：SCXK（瓊）2020-0007，飼養于（20±2） ℃、（55±5）%濕度、12 h/12 h明暗循環的動物房中，使用許可證號：SYXK（瓊）2017-0013。所有動物均自由攝食飲水。本研究所有動物程序均經海南醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準（202112-14）。

1.2 方法

1.2.1 構建TBI小鼠模型 麻醉小鼠，備皮消毒后，頭皮矢狀切開，露出顱骨，在右側頭蓋骨bregma和lambda之間矢狀縫合線外側2 mm處鉆一個直徑3.5 mm的開口，假手術組即可完成手術。對于實驗組小鼠，暴露硬腦膜后進行撞擊腦挫傷，撞擊速度為4.5 m/s，撞擊持續時間為150 ms，深度為1.5 mm。擊打結束后，立即縫合切口，使用加熱墊對動物進行保暖，等待麻醉恢復。模型小鼠在損傷后24 h側腦室注射0.5 nmol的miR-145 agomir或等濃度的陰性對照NC agomir。在損傷后第3天立即解剖海馬組織，并在液氮中快速冷凍，用于后續實驗。

1.2.2 改良神經損傷嚴重程度（mNSS）評分 mNSS評分用于評估創傷后神經功能。該測試包括運動（肌肉狀態、異常運動）、感覺（視覺、觸覺和本體感覺）、平衡木和反射測試。mNSS評分為0～18分，分數越大表示損傷越嚴重。本研究中，mNSS在TBI后的第1、3、5、9、14天進行評估。mNSS評分由兩名不負責此研究的觀察員進行評估。

1.2.3 莫里斯水迷宮（MWM） 迷宮是一個直徑120 cm、深度50 cm的圓形水槽。水槽中裝有深度為30 cm、溫度為25 ℃的水。將水箱分成4個相等的象限，然后在一個象限的中心水面下1 cm處隱藏一個黑色圓形平臺。所有小鼠在TBI后14 d連續訓練5 d。在空間學習訓練中，小鼠被隨機放入迷宮中自由游泳直至找到平臺。如果1只小鼠在60 s內找不到平臺，則在平臺上休息30 s。第6天，從任意方向測試，記錄每只小鼠的運動情況，利用追蹤分析軟件評估小鼠認知功能。

1.2.4 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液裂解同側海馬組織。每組中等量的蛋白質用SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后將蛋白質轉移至PVDF膜。室溫下采用5%脫脂牛奶封閉膜1 h，隨后將膜與一抗4 ℃過夜孵育，結束后與二抗在室溫下孵育1 h。使用增強化學發光試劑顯現條帶。最后，使用Image J軟件分析量化蛋白質表達。

1.2.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用Trizol試劑按照說明書從海馬組織中提取總RNA。檢測miRNA表達時，使用TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒，根據說明書將其逆轉錄為cDNA。檢測mRNA表達時，使用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。根據制造商的說明，使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行RT-qPCR分析。目的基因的相對表達量使用2-ΔΔCt方法計算。mRNAs或miRNAs分別使用GAPDH或U6作為內部對照。

1.2.6 ELISA 從損傷的大腦半球取海馬組織勻漿。根據制造商說明，使用ELISA試劑盒檢測海馬組織中促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和抗炎細胞因子IL-4、IL-10和TGF-β濃度。

1.2.7 TUNEL染色 將組織切片脫蠟并與0.1%Triton X-100在室溫下孵育10 min。檸檬酸鹽緩沖液高溫修復10 min后，將組織用TUNEL溶液在37 ℃下孵育60 min，然后用NeuN抗體4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌3次，并與Cy3標記的山羊抗小鼠IgG在室溫下孵育60 min。用抗熒光淬滅劑封片，并使用熒光顯微鏡觀察外傷性病灶周圍凋亡神經元細胞的數量。

1.2.8 流式細胞術 流式細胞術檢測腦組織Treg淋巴細胞。取小鼠腦組織并制備腦組織單細胞懸液，使用小鼠Tregs染色試劑盒對分離的細胞進行染色。簡而言之，用抗小鼠CD4-FITC和抗小鼠CD25-PE對細胞于4 ℃下染色30 min固定，然后用固定/透化溶液在4 ℃下透化過夜，隨后用抗小鼠Foxp3-APC抗體染色，最后上機進行流式細胞分析。

1.2.9 免疫組化 將小鼠麻醉后，灌注4%多聚甲醛。隨后立即取腦組織，4%多聚甲醛室溫固定24 h。制作腦組織石蠟切片，用梯度乙醇和二甲苯脫蠟，在檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中煮沸以修復組織抗原。PBS洗3次，將切片與3%過氧化氫（H2O2）孵育20 min，然后用3%牛血清白蛋白孵育60 min阻斷非特異性結合。預處理后，將切片與兔抗小鼠Iba-1抗體孵育過夜。然后與生物素化的抗兔IgG在室溫下孵育2 h。最后用抗生物素蛋白-生物素辣根過氧化物酶（HRP）復合物識別結合的抗體，并使用二氨基聯苯胺溶液進行可視化檢測HRP活性。每個切片中Iba-1陽性細胞的數量由兩名對研究條件不了解的獨立觀察者在挫傷腦組織的5個區域中計數，計算陽性細胞數量。

1.3 統計學分析 使用SPSS22.0統計軟件進行統計分析。實驗結果以±s表示。兩組之間使用t檢驗進行分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-145對TBI術后小鼠神經功能的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠海馬組織中miR-145表達顯著降低，逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少，嚴重程度評分顯著升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠海馬中miR-145表達顯著升高，逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，小鼠第3、5、9、14天神經損傷嚴重程度評分顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-145對TBI術后小鼠神經功能的影響Fig.1 Effect of miR-145 on neurological function of mice after TBI

2.2 miR-145對TBI術后小鼠腦組織中Tregs的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠腦組織中Tregs在CD4+T細胞群中的百分比降低（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠腦組織中Tregs細胞在CD4+T細胞群中的百分比顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 miR-145對TBI術后小鼠腦組織中Tregs的影響Fig.2 Effect of miR-145 on Tregs in mice brain after TBI operation

2.3 miR-145對TBI術后小鼠炎癥細胞因子的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10和TGF-β表達水平顯著升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠海馬中促炎因子IL-1β、IL-6、TNFα表達水平顯著降低，抗炎因子IL-4、IL-10和TGF-β表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 miR-145對TBI術后小鼠炎癥細胞因子的影響Fig.3 Effect of miR-145 on inflammatory cytokines in mice after TBI operation

2.4 miR-145對TBI術后小膠質細胞/巨噬細胞極化的影響 與Sham組比較，TBI組活化的小膠質細胞/巨噬細胞Iba-1數量增多（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組活化的小膠質細胞/巨噬細胞Iba-1數顯著減少（P＜0.05），見圖4。

圖4 miR-145對TBI術后小膠質細胞/巨噬細胞極化的影響Fig.4 Effect of miR-145 on microglia/macrophage polarization after TBI

2.5 miR-145對TBI術后M1/M2小膠質細胞/巨噬細胞極化的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠M1小膠質細胞標志物基因iNOS和CD11b以及M2小膠質細胞標志物基因CD206和Arg1表達水平顯著升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠M1小膠質細胞標志物基因iNOS和CD11b表達水平顯著降低，而M2小膠質細胞標志物基因CD206和Arg1表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 miR-145對TBI術后M1/M2小膠質細胞/巨噬細胞極化的影響Fig.5 Effect of miR-145 on M1/M2 microglia/macrophage polarization after TBI

2.6 miR-145對TBI術后海馬細胞神經元凋亡的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠海馬神經元凋亡數量顯著增加，凋亡神經元占總NeuN陽性神經元中的百分比升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠凋亡的神經元數量顯著減少，凋亡神經元占總NeuN陽性神經元中的百分比顯著降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 miR-145對TBI術后神經細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of miR-145 on nerve cell apoptosis after TBI

2.7 miR-145對TBI后小鼠海馬Notch信號通路的影響 與Sham組比較，TBI組小鼠海馬中Notch1、p21和Hes1 mRNA和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）；與TBI+NC agomir組比較，TBI+miR-145 agomir組小鼠海馬中Notch1、p21和Hes1 mRNA和蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 miR-145對TBI術后Notch信號通路的影響Fig.7 Effect of miR-145 on Notch signaling pathway after TBI

3 討論

研究表明，TBI后持續的小膠質細胞活化有助于神經變性和相關神經損傷的進展［10］。此外，多項研究計算了患者和創傷性腦損傷動物的miRNA譜，并確定了創傷性腦損傷中潛在的miRNA生物標志物［11-12］。然而，miR-145在TBI中的作用報道較少。為了研究miR-145在TBI中的作用，本研究構建TBI小鼠模型，通過側腦室注射miR-145激動劑上調TBI后miR-145水平。首先研究miR-145對TBI術后神經功能結果的影響，結果發現過表達miR-145顯著改善了TBI模型誘發的神經功能障礙。

此外，本研究證明了TBI后小鼠miR-145的抗炎和免疫調節特性。Treg是T淋巴細胞的一個子集，具有調節免疫/炎癥功能的能力。Tregs可減少腦損傷，減少免疫/炎癥細胞浸潤和小膠質細胞激活，降低促炎細胞因子分泌，提高抗炎細胞因子水平［13］。本研究發現在TBI后3 d，腦組織中Tregs水平降低。過表達miR-145可顯著增加中樞神經系統中Tregs數量。既往研究報道，TBI患者中Tregs水平顯著降低，表明Tregs增加可能改善TBI的預后［14］。這與本研究結果一致。因此，增加Tregs可能在TBI中由miR-145治療誘導的神經保護和免疫/炎癥調節中起關鍵作用。

炎癥是多種神經退行性疾病及其相關神經病理學的潛在組成部分。急性神經炎癥通過引發促進細胞因子和/或趨化因子的分泌，以及中樞神經系統小膠質細胞的活化損害腦細胞［15］。本研究發現在小鼠TBI模型中，過表達miR-145顯著抑制神經炎癥，促炎細胞因子減少，抗炎細胞因子增加，并顯著減輕了小膠質細胞活化。腦損傷后，活化的小膠質細胞/巨噬細胞作為中樞神經系統炎癥過程中的主要執行者，在細胞形態和行為上發生了顯著變化［16］。小膠質細胞/巨噬細胞可根據其宿主組織微環境分化為有害表型（M1）或有益表型。據報道，小膠質細胞/巨噬細胞的過度M1樣激活也可誘發慢性炎癥，阻止組織修復并誘發繼發性損傷［17］。M2小膠質細胞/巨噬細胞被認為是M1的抗衡物，有助于損傷后的恢復，并分泌IL-10、IL-4、IL-13等抗炎介質及各種神經營養因子，以保持組織的完整性［18-19］。本研究通過分析與M1或M2相關的特征基因在海馬的表達評估大腦小膠質細胞的極化，結果發現過表達miR-145后，M1小膠質細胞標志物基因iNOS和CD11b表達降低，M2小膠質細胞標志物基因CD206和Arg1表達水平顯著升高，提示miR-145通過促進小膠質細胞/巨噬細胞從M1向M2表型的轉變而發揮抗炎作用。

近期研究報道，腦損傷后Notch信號通路可被激活，并參與激活的小膠質細胞中神經炎癥介質的釋放。抑制Notch通路可減輕腦細胞損傷，改善功能［20］。此外，Notch信號通路在其他組織的損傷中也發揮重要作用。例如，抑制Notch通路可減輕急性腎損［21］。Notch信號是由許多miRNAs調控的，已有研究報道miR-145在Notch信號通路中發揮關鍵作用［22］。本研究結果表明，過表達miR-145可降低Notch1、Hes1和p21蛋白表達，提示miR-145可能通過抑制Notch信號通路促進海馬小膠質細胞的M2極化及海馬神經元凋亡。

綜上所述，本研究表明過表達miR-145可通過減少創傷后神經炎癥反應和免疫調節改善行為功能障礙，提高Treg水平，促進小膠質細胞M2極化，這可能是通過抑制Notch信號通路介導的。因此，miR-145有望成為改善創傷性腦損傷的有效治療手段和潛在靶標。