胃癌前病變病證結合動物模型研究進展*

王穎 矯健鵬 徐晶鈺 劉煊 王曉煒 岳小強**

(1.山東中醫藥大學,山東 濟南 250355;2.海軍軍醫大學附屬長征醫院,上海 200003)

胃癌(Grastic Cancer,GC)是全球第三大癌癥,更是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]。根據國家癌癥中心的數據,2020年我國癌癥新發病例數中胃癌48萬、死亡人數37萬,分別位于第三位和第二位。胃癌前病變(precancerous lesions of gastric cancer,PLGC)是指一類容易發生癌變的胃黏膜病理組織學變化,主要包括胃黏膜上皮異型增生和腸上皮化生兩種類型,多伴存于慢性萎縮性胃炎中。PLGC是胃癌發生前的一個重要階段,加強對其相關研究,積極進行早診早治,對于降低我國胃癌發病率、改善患者預后至關重要。近年來,中醫藥在參與胃癌前病變防治中的作用和地位越來越受到重視[2]。辨證論治是中醫藥的特色與優勢,病證結合動物模型則是在中醫藥理論、現代醫學理論和實驗動物科學等知識的相結合下,在動物身上模擬出與疾病和證候相類似的特征[3],非常適合進行中醫藥相關的胃癌前病變研究。本文就胃癌前病變研究中病證結合動物模型的制備方法做一總結。

1 模型動物的選擇

因為PLGC造模時間較長,大鼠為最常用的實驗研究對象,品系主要為Wistar和SD大鼠,多選擇雄性或雌雄各半。近年來,基因敲除小鼠也被引入到PLGC動物模型中,如胃泌素敲除小鼠(GAS-/)、IL-1β轉基因小鼠(C57 BL/6品系)、K-ras轉基因小鼠、Tff 1基因敲除小鼠(Tff 1-/)、p53基因敲除小鼠、Klf4基因敲除小鼠都以C57 BL/6品系小鼠為主,胰島素胃泌素轉基因小鼠(INS-GAS,FVB/N品系)、Apt4a基因敲除小鼠(H+/K+-ATP酶缺失,C57)等[4-5]?；蚯贸齽游锬Ｐ碗m然成模效果顯著,但對于模型小鼠要求較高,且制作成本高,目前實際應用仍較少。

2 PLGC疾病模型

疾病造模是病證結合動物模型的基礎。目前學者針對PLGC多以復合因素造模,通過化學誘變劑甲基硝酸亞硝酸胍(1N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)自由飲用或灌胃誘發黏膜病變,配合饑飽失常、乙醇(白酒)灌胃、瀉下藥物、高熱食物(60℃熱面糊)、情緒刺激(夾尾)、勞累刺激等方式,來模擬人PLGC的發生機制。MNNG是一種N-亞硝基化合物,作用機制為分解成短壽命、高反應的親電試劑,最終的誘變劑被認為是堿離子。Sugimura等于1967年首次發現將飲用水混合MNNG溶液喂養大鼠會誘發胃腺癌[6]。大鼠前胃對MNNG有很高的親和力,MNNG直接作用于胃黏膜而引起癌變,致癌機制為損傷細胞DNA,故常應用于胃癌及癌前病變中[7]。MNNG的給藥方式分為自由飲用和灌胃,并且實驗結果與濃度相關,其中自由飲用的濃度為60～180 μg·mL-1,灌胃的濃度為80～250 μg·mL-1,造模時間大約在20～24周不等[8-9]。

3 病證結合動物模型

目前中醫學者根據胃癌前病變患者的典型表現,認為其臨床證候主要有脾胃虛弱、胃陰不足、肝胃氣滯、脾胃濕熱和胃絡瘀血證五大類型[10]。

3.1脾胃虛弱病證結合模型 “脾胃虛弱”為CAG及其癌前病變的發病之本[11],也是其核心病機與證候。鄭嘉怡等[12]采用200 μg·mL-1MNNG自由飲用配合饑飽失常法(隔日禁食)復制PLGC脾虛證大鼠模型,在研究過程中發現,造模18周后雄性SD大鼠出現食欲不振、精神萎靡、便溏等癥狀,與臨床PLGC脾虛證表現相似。病理顯示腸上皮化生、異型增生,黏膜下血管密布,出現擴張微血管,甚至一只大鼠出現原位癌病變。朱萱萱等[13]通過每周兩次采用170 μg·mL-1的MNNG溶液和40%乙醇對大鼠進行灌胃,并給予150 μg·mL-1的MNNG溶液自由飲用,造模10周,采用破氣苦降(耗氣瀉下藥)、第五周饑飽失常(單日禁食、雙日飽食)和大鼠疲勞儀(大鼠每天跑步30 min)建立CAG脾氣虛模型。10周后SD大鼠體重和體溫明顯降低,攝食量和飲水量降低不明顯,提示脾虛證成模,而在第4周就會開始出現腸化生、不典型增生等PLGC病理。張宏等[14]使用過食酸味而致脾虛的方法進行造模[15],饑餓48 h后灌胃山西白醋(首次每日15 mL·kg-1,以后每日10 mL·kg-1),10 日后以酸度3.5 g·100 mL-1的2-乙基亞硝胺(每日2.8 mg·kg-1)灌胃,每日1次,連續灌胃4個月,120天后NIH小鼠出現體重減輕、食欲減退,活動量減少,大便溏泄或成小干顆粒狀等表現。

3.2胃陰不足病證結合模型 李明等[16]和張楊等[17]都以100 μg·mL-1MNNG溶液灌胃,配合35%的無水乙醇每周一、四灌胃,60℃熱面糊每周二、五灌胃,含0.3 g·kg-1雷尼替丁飼料喂養來構建PLGC胃陰不足證候模型。16周后模型組多數Wistar大鼠出現精神狀態欠佳,行動遲緩,被毛疏松暗淡,食欲較差、形體偏瘦,大便時有不成形等胃陰不足的癥狀,肉眼觀察到胃壁彈性較差,顏色偏白,病理檢測出現腸化生。沈琪等[18]予100 μg·mL-1MNNG溶液自由飲用,以含0.03%雷尼替丁飼料喂養,加以饑飽失常法(飲食2天,禁食1天)、禁食下午灌胃40%乙醇10 mL·kg-1、下午灌胃0.017 濃度MNNG溶液1 mL·kg-1造模,12周后模型組SD大鼠出現了精神萎靡、形態偏瘦、行動遲緩、噯氣等表現,病理顯示胃黏膜較薄,光澤度不夠,彈性較差,病理顯示出現不同程度的異型增生,成功地建立了PLGC胃陰不足證大鼠模型。

3.3肝胃氣滯病證結合模型 PLGC發病與情緒明顯相關,肝胃氣滯證動物模型的建立多通過夾尾刺激或慢性束縛來進行證候造模。胡運蓮[19]予Wistar雄性大鼠自由飲用100 μg·mL-1MNNG,以含0.03%雷尼替丁的飼料喂養,采用饑飽失常法,進食2天,禁食1天。以10 mL·kg-1為計量標準,灌胃56℃15%鹽水,進食下午灌胃20 mmol(0.85%)脫氧膽酸鈉溶液,禁食下午灌胃40%的酒精。每周用鉗子夾大鼠尾部30分鐘,使之保持憤怒狀態。連續造模24周,發現模型組大鼠體型偏瘦,食欲減退,大便質稀。病理上出現2例增生結節,組織學檢查分別為早期腺癌和增生性息肉,提示肝胃氣滯成模。

3.4脾胃濕熱病證結合模型 近年來,由于生活水平的提高和飲食習慣的改變,人們嗜食肥甘厚味,濕熱交阻而導致脾胃濕熱證胃癌前病變患者日益增多。脾胃濕熱證動物模型的建立多模擬濕熱環境或高脂高糖飲食來造模,以大鼠出現大便時溏時結、臭穢,且有生化指標改變來提示造模成功。黃琴等[20]通過15日的“濕熱環境加高脂高糖飲食和白酒綜合法”來復制脾胃濕熱證模型,再進行12周的灌服150 g·L-1濃度的55 ℃ 熱鹽水10 mL·kg-1,2%水楊酸(10 mL·kg-1,日1次)、飲用20 mmol·L-1脫氧膽酸鈉,加以饑飽失常綜合法(進食2日,禁食1日)來復制胃癌前病變模型。結果顯示,12周后SD大鼠喜靜,食欲下降,反應緩慢,大便時干時稀、臭穢難聞,胃黏膜腺體出現大部分萎縮消失的狀況,可見腸上皮化生,提示造模成功。

3.5胃絡瘀血證病證結合模型 中醫認為“久病必有瘀”,PLGC多由CAG發展而來,病程時間較長,久病易使氣血運行不暢,出現瘀血證候。旲佳慧[21]以150 μg·mL-1MNNG溶液予SD大鼠自由飲用,15%濃鹽水灌胃(禁食日、2 mL·只-1),配合饑飽失常(2天進食1天禁食)和0.03%雷尼替丁飼料喂養,建立PLGC大鼠模型。24周后,模型組大鼠精神較差,糞便不成形,胃黏膜充血水腫,甚至黏膜下血管分布,與中醫血瘀證候相似,且大量炎性細胞被浸潤,可見不典型增生細胞,提示造模成功。劉慶生等[22]]以167 μg·mL-1MNNG溶液自由飲用,以0.017 mol·L-1濃度的MNNG溶液灌胃,1 mL·只-1,復制PLGC大鼠模型,12周后模型組SD大鼠皮毛暗淡,易受刺激,胃黏膜色暗發灰、少澤,部分出現出血糜爛點,與中醫血瘀證候中出血癥狀相似。封慧等[23]采用以10 mL·kg-1的大鼠體重為計量標準,每周灌胃1次含0.03%雷尼替丁的MNNG溶液170 mg·L-1、每周2次400 mL·L-1乙醇,通過用這種綜合造模法建立PLGC模型,造模12周后模型組SD大鼠體重明顯減輕,增長速度緩慢,胃黏膜明顯變薄,顏色偏白灰色,有散在出血點,部分水腫糜爛,舌質出現紫暗,并發血瘀證候。

4 病證結合動物模型的評價

在PLGC的動物模型中,以胃黏膜出現萎縮并伴有腸上皮化生或異型增生為主要的疾病成模標準。脾胃虛弱證的成模標準為:大鼠食欲不振,大便溏,喜靜,苔薄白;胃黏膜蒼白或灰白,黏膜變薄,黏液量多稀薄,胃蠕動變弱。胃陰不足證的成模標準為:大鼠形體消瘦,大便干結,舌紅少苔;胃黏膜表面不平變薄,黏液減少,皺襞變細或消失,呈龜裂樣改變。肝胃氣滯證的成模標準為:大鼠表現為易激惹;胃黏膜呈急性活動性炎性反應,胃蠕動較快。脾胃濕熱證的成模標準為:大鼠大便黏膩或稀滯,舌紅苔黃膩;胃黏膜糜爛、充血紅腫,黏液渾濁黏稠。胃絡瘀血證的成模標準為:大鼠表現為舌暗紅,有瘀斑、瘀點;胃黏膜存在出血點,血管呈暗紅色[24]。

5 問題與展望

在病證結合動物模型中,疾病造模多以MNNG水溶液予動物自由飲用或灌胃為主,證候造模則在中醫理論指導下進行。MNNG因其造模操作相對簡便、成模率較高,因而在目前多數胃癌前病變研究中被廣泛應用;其雖然作為常用的PLGC造模試劑,但目前文獻中對于造模周期、死亡率的研究較少,使得MNNG造模技術運用中仍存在很多懸而未決的實際問題;而且,MNNG的發病機制與人類發病機制存在較明顯的差別,使得其用于對PLGC疾病分子機制探討上可能還存在一定問題[25-29]。

在中醫證候造模中,雖然病證結合動物模型的研究取得了一定的進展,但在模型判定上大致符合人體證候表現,而人體與動物發病機制存在顯著差異,故此類造模方法未得到眾多研究人員認同;并且不同病證結合的造模方法不盡相同,未明確統一標準。中醫證候動物模型的診斷依據應包括癥狀(本證)、病因(正證)、治療(反證)、相關因素(佐證)、客觀指標(佐證)五個方面[30],但目前多數證候動物模型尚不能滿足以上全部五個標準。另外,病證結合動物模型由于干預措施復雜、步驟較多,客觀上導致造模的可重復性較差。

總之,PLGC的發病周期長、機制復雜,其病證結合動物模型的研究雖然取得了一定進展,但還存在諸多實際問題,需要廣大科研工作者在不斷的實踐中,不斷發現并加以改進。