基于動物實驗系統評價大黃素治療糖尿病腎病的可行性

何 望，黃國順，張凱鈺，周恩超

（1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029）

由于糖尿病的發病率和患病率在全球持續增加，糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）的患者也隨之增加，總體增加的病例數量對糖尿病腎病的進展產生了極大的影響［1］。DKD 是糖尿病患者常見的并發癥［2］，在我國，糖尿病人群居世界首位，人數已超1 億，而在歐美發達國家，DKD 發病率隨著生活環境、飲食結構的改變等各種原因，也呈逐年上升趨勢，近幾年更是達到了頂峰。有報道稱，在美國，大約30%～40% 的糖尿病患者發生DKD［3］，DKD 成為除腎小球腎炎外導致終末期腎?。‥SRD）的主要病因［4］。DKD 在早期通常以微量白蛋白尿為臨床表現，隨著病情的發展變化，腎功能也會逐漸出現異常［5］。DKD 的發病機制多樣且復雜，盡管沒有完全闡明，但有學者提出了血流動力學異常、炎癥介質、血脂紊亂等學說［6］，其中足細胞損傷、Nephrin 的異常表達已被認為是關鍵因素。足細胞位于腎小球毛細血管外的腎小球基底膜上，而Nephrin 是一種主要的足細胞細胞骨架蛋白和狹縫隔膜結構蛋白，當足細胞損傷，Nephrin 表達異常時，腎小球濾過膜的完整性遭到破壞，蛋白尿也隨之產生［7］。目前，DKD 的臨床治療較為單一，缺乏針對性更強，有效性更佳的治療手段。大黃素（emodin，EM） 是蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatumL）、唐古特大黃（Rheum tanguticumMaxim.ex Balf）和藥用大黃（Rheum offcihaleBaill）的有效活性成分，屬于蒽醌類化合物，具有抑菌、抗炎、調節免疫、抗腫瘤、改善腎功能等藥理作用［8］，但其具體作用機制尚在研究中。本研究以Meta 分析為探究方法，以動物實驗為研究基礎，探討大黃素保護腎臟的相關理論。

1 資料與方法

1.1 資料來源與檢索策略

兩名研究者（黃國順，何望） 用中文檢索詞“大黃 素”、“大 鼠”、“小 鼠”、“動 物 模 型”“實 驗”、“腎病”、“糖尿病”、“糖尿病腎病”為主題詞分別檢索中文數據庫：中國學術期刊全文數據庫、萬方數據庫、中文科技期刊數據庫 ，中國生物醫學文獻數據庫；以“archen or emodin” and “diabetic nephropathy or diabetic”為檢索公式檢索PubMed、The Cochrane Library、Web of science 數據庫，檢索時間為建庫至2023 年2 月25 日。

1.2 納入及排除標準

關于大黃素保護糖尿病鼠腎臟的動物實驗研究均被納入； 排除結局指標不包括主要結局指標之一的研究，非動物實驗研究（如綜述類文章等），雷同研究及大黃素類似物的研究。

1.3 資料提取

由2 名研究員（何望、張凱鈺）根據納入和排除準篩選文獻，提取內容包括納入研究的一般情況（包括作者、年齡等）；動物基本情況（大/小老鼠、種屬等）；實驗方法（大黃素濃度、造模方式等），反映研究質量指標；完成后交叉核對，若兩人意見不統一，則通過團隊其他成員共同討論，協助判斷。

1.4 評價與分析

采用動物實驗偏倚風險評估工具（ the systematic re- view centre for laboratory animal experimentation，SYRCLE）［9］。選用RevMan 5.4 統計分析：（1）Chi2 檢驗進行異質性分析，效應量以95%CI表示，固定效應模型適用于異質性較小的情況（P＞0.1，I2＜50%），反之則使用隨機效應模型。（2）計數資料用相對危險度RR，連續性變量用標準化均數差SMD。（3）采用漏斗圖分析納入文獻的偏倚情況。

2 結果

2.1 文獻檢索結果

數據庫檢索獲得文獻（n=746），剔除內容重復文獻67 篇（n=679），閱讀文章摘要及關鍵詞，剔除非糖尿病腎病、細胞實驗、臨床試驗、理論研究（臨床經驗、醫案、綜述）、基礎研究、系統評價、Meta 分析（n=639）；精讀全文，再排除26 篇：包括學位論文（n=6）；干擾措施包含其他中藥提取物（n=13）；觀察指標不含主要結局指標（n=7）。最終納入Meta分析文獻（n=14），見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖Fig 1 Flowchart of literature screening

2.2 文獻基本特征

經過嚴格篩選，最終納入14 篇文獻： Chen等［10］、Jing 等［11］、Liu 等［12］、Tian 等［13］、Wang 等［14］、劉聰 等［15］、李 杭 霖 等［16］、李 萌 等［17］、楊 秀 等［18］、王 軍等［19］、趙瀚微等［20］、趙良瑞等［21］、陶松青等［22］、齊寶寧等［23］，合計304 只大鼠，其中模型組152 只，干預組152 只。具體特征詳見表1。

表1 納入文獻的基本信息Tab 1 Basic information of included literature

2.3 方法學質量評價

應用上文中提到的評估工具開展質量評價：序列產生方面：14 篇研究中均有提出，有3 篇指明具體的分配序列的方法，判定其偏倚風險較低，另有3 篇的隨機方法存在高風險，其余研究中只提及隨機，偏倚風險尚不清楚。動物安置隨機化方面：有11 篇文獻具體描述了各組動物的安置條件，偏倚風險較低。結果評估隨機性：有2 篇文獻從造模成功的大鼠中隨機抽取，認為其中偏倚風險較低，其余則均未提及。在結果評價盲法方面、基線特征、分配隱藏、等其他方面：具體評價結果見圖2。

圖2 納入文獻偏倚風險評估Fig 2 Risk assessment of bias of included literature

2.4 模型組與大黃素組的Meta 分析

2.4.1 血糖 有 9 篇研究報道了血糖的變化。因分析顯示異質性較大，故選擇隨機效應模型，結果顯示：SMD=-2.51，95%CI（-3.77，-1.24），I2＝89%。大黃素組較模型組血糖低（圖3）。為探索可能的異質性來源，按大黃素濃度、給藥療程、動物種屬分別進行亞組分析（圖4～6）。亞組分析顯示不同大黃素濃度分組間交互P檢驗示（P=0.96，I2=0%）（圖4）。不同療程分組間交互P檢驗示（P=0.004，I2=88.1%）（圖5）。不同動物種屬分組間交互P檢驗示（P=0.55，I2=0%）（圖6），亞組分析表示：療程對血糖異質性的影響較大，而大黃素濃度、動物種屬對異質性的影響較小。

圖3 大黃素組vs 模型組血糖的Meta 分析Fig 3 Meta-analysis of blood glucose between the emodin group and the model group

圖4 按大黃素濃度進行亞組分析：大黃素組vs 模型組血糖的Meta 分析Fig 4 Subgroup analysis by emodin concentration： Meta-analysis of blood glucose in the emodin group vs the model group

圖5 按療程進行亞組分析：大黃素組vs 模型組血糖的Meta 分析Fig 5 Subgroup analysis by treatment course： Meta-analysis of blood glucose in the emodin group vs the model group

圖6 按動物種屬進行亞組分析：大黃素組vs 模型組血糖的Meta 分析Fig 6 Subgroup analysis by animal species： Meta-analysis of blood glucose in the emodin group vs model group

2.4.2 血肌酐 有7 篇研究報道了實驗后血肌酐的變化。結果顯示：SMD=-1.62，95%CI（-4.75，-1.34），I2＝91%（圖7），大黃素組較模型組血肌酐水平降低。為探索可能的異質性來源，按大黃素濃度、給藥療程、動物種屬分別進行亞組分析（圖8～10）。亞組分析顯示大黃素不同的濃度分組間交互P檢驗示（P=0.21，I2=36.3%）（圖8）。不同療程分組間交互P檢驗示（P=0.04，I2=76.5%）（圖9）。不同動物種屬分組間交互P檢驗示（P=0.03，I2=77.8%）（圖10），亞組分析表示：大黃素弄濃度、療程、動物種屬對異質性的影響較小。

圖7 大黃素組vs 模型組血肌酐的Meta 分析Fig 7 Meta-analysis of blood creatinine between the emodin group and the model group

圖8 按照大黃素濃度進行亞組分析：大黃素vs 模型組血肌酐的Meta 分析Fig 8 Subgroup analysis by concentration of emodin： Meta-analysis of blood creatinine in the emodin group vs the model group

圖9 按照療程進行亞組分析：大黃素vs 模型組血肌酐的Meta 分析Fig 9 Subgroup analysis by treatment course： Meta-analysis of blood creatinine in the emodin group vs the model group

圖10 按照動物種屬進行亞組分析：大黃素vs 模型組血肌酐的Meta 分析Fig 10 Subgroup analysis by animal species： Meta-analysis of blood creatinine in the emodin group vs the model group

2.4.3 尿素氮 有7 篇研究報道了實驗后尿素氮的變化。結果顯示：SMD=-2.69，95%CI（-3.88，-1.50），I2＝82%（圖11），大黃素組較模型組低尿素氮水平降低。為探索可能的異質性來源，按大黃素濃度、給藥療程、動物種屬分別進行亞組分析（圖12～14）。亞組分析顯示大黃素不同的濃度分組間交互P檢驗示（P=0.18，I2=45.5%）（圖12）。不同療程分組間交互P檢驗示（P=0.000 5，I2=91.6%）（圖13）。不同動物種屬分組間交互P檢驗示（P=0.26，I2=22.3%）（圖14），亞組分析表示：療程的不同可能是結果的異質性來源，而大黃素弄濃度、動物種屬對異質性的影響較小。

圖11 大黃素組vs 模型組尿素氮的Meta 分析Fig 11 Meta-analysis of urea nitrogen between the emodin group and the model group

圖12 按照大黃素濃度進行亞組分析：大黃素vs 模型組尿素氮的Meta 分析Fig 12 Subgroup analysis by concentration of emodin： Meta-analysis of urea nitrogen in the emodin group vs the model group

圖13 按照療程進行亞組分析：大黃素vs 模型組尿素氮的Meta 分析Fig 13 Subgroup analysis by treatment course： Meta-analysis of urea nitrogen in the emodin group vs the model group

圖14 按照動物種屬進行亞組分析：大黃素vs 模型組尿素氮的Meta 分析Fig 14 Subgroup analysis by animal species： Meta-analysis of urea nitrogen in the emodin group vs the model group

2.4.4 UTP 有6 篇研究報道了實驗后UTP 的變化。結 果 顯 示：SMD=-3.35，95%CI（-4.85，-1.85），I2＝87%（圖15），大黃素組較模型組可以降低UTP 水平。為探索可能的異質性來源，按給藥濃度、療程、動物種屬分別進行亞組分析（圖16～18）。亞組分析顯示大黃素不同的濃度分組間交互P檢驗示（P=0.54，I2=0%）（圖16）。不同療程分組間交互P檢驗示（P=0.01，I2=84.6%）（圖17）。不同動物種屬分組間交互P檢驗示（P=0.22，I2=32.4%）（圖18），亞組分析表示：大黃素濃度、療程、動物種屬對異質性的影響較小。

圖15 大黃素組vs 模型組UTP 的Meta 分析Fig 15 Meta-analysis of UTP between the emodin group and the model group

圖16 按照大黃素濃度進行亞組分析：大黃素vs 模型組UTP 的Meta 分析Fig 16 Subgroup analysis by concentration of emodin： Meta-analysis of UTP in the emodin group vs the model group

圖17 按照療程進行亞組分析：大黃素vs 模型組UTP 的Meta 分析Fig 17 Subgroup analysis by treatment course： Meta-analysis of UTP in the emodin group vs the model group

2.4.5 相對腎重 有3 篇研究報道了動物的相對腎重的變化。結果顯示：SMD=-7.72，95%CI（-12.55，-2.88），I2＝90%（圖19），結果提示與模型組相比，大黃素組對減輕相對腎重作用更大。

圖19 大黃素組vs 模型組相對腎重的Meta 分析Fig 19 Meta-analysis of relative kidney weight between the emodin group and the model group

2.4.6 TC、TG 有2 篇研究報道了實驗后甘油三酯 的 變 化。 結 果 顯 示：SMD= - 1.19，95%CI（-2.92，-0.55），I2＝77%（圖20），大黃素組較模型組可以降低甘油三酯水平。有3 篇研究報道了實驗后膽固醇的變化。結果顯示：SMD=-1.24，95%CI（-1.94，-0.54），I2＝0%（圖21），但其差異無統計學意義。

圖20 大黃素組vs 模型組TC 的Meta 分析Fig 20 Meta-analysis of UTP in the emodin group vs the model group

圖21 大黃素組vs 模型組TG 的Meta 分析Fig 21 Meta analysis of TG in the emodin group vs the model group

2.5 描述性分析

2.5.1 大黃素可通過上調nephrin 的表達降低蛋白尿，從而減輕足細胞的損傷，有效延緩DN 的進程。

有3 篇研究報道了大黃素保護DN 的腎損傷主要是通過上調 nephrin 的表達，3 篇研究中均顯示，與對照組相比，大黃素對STZ 誘導的糖尿病大鼠nephrin 表達下降有顯著的改善作用。提示大黃素可通過上調nephrin 的表達降低蛋白尿，減輕足細胞的損傷。

2.5.2 大黃素減輕糖尿病腎病小鼠腎臟的病理改變 有6 篇研究報道了實驗后腎臟病理結構的改變，發現與對照組相比，經大黃素治療的大鼠足細胞足突消失明顯減少，從而使足細胞損傷明顯減輕。

2.5.3 大黃素作用于不同的信號通路，改善糖尿病腎病大鼠模型腎損害和足細胞損傷。有4 篇研究從不同的通路解釋了大黃素治療糖尿病腎病的可能性。Jing 等［11］提出大黃素在大鼠模型中對糖尿病腎病的腎保護作用是通過PI3K/Akt/GSK3β 和Bax/caspase3 信 號 通 路 介 導 的。Liu 等［12］認 為 大 黃 素 通過調節AMPK/mTOR 介導的自噬信號通路改善糖尿病腎病大鼠模型腎損害和足細胞損傷。齊寶寧等［23］發現大黃素調控miR-21 介導細胞自噬，減輕糖尿病腎病小鼠腎臟氧化性損傷。Tian 等［13］論述了大黃素對糖尿病腎病的保護機制的關鍵在于大黃素能夠抑制相關通路，如PERK 通路，來減輕糖尿病腎病足細胞凋亡。

2.5.4 大黃素可調節多種蛋白的表達，改善糖尿病老鼠腎臟的損傷。 納入的研究中，有6 篇研究認為大黃素對糖尿病腎臟的保護與某些蛋白密切相關。在Jing 等［11］研究中發現，大黃素對改善糖尿病大鼠的血糖、尿白蛋白排泄量、腎臟重量、腎功能等作用明顯。大黃素具有抗炎和抗氧化活性的作用，此研究進一步發現，經大黃素干預后，ICAM-1、Bax等被抑制 ，而相反Akt/GSK-3β 信號通路被激活。在Liu 等［12］研究中認為大黃素顯著上調了STZ 誘導的糖尿病大鼠 nephrin 表達下降。提示大黃素可通過上調nephrin 的表達降低蛋白尿，從而有效延緩了DN 的進程。在Tian 等［13］研究中提出大黃素可抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK）途徑，同時抑制細胞增殖和纖連蛋白（FN）表達，尤其是對于暴露于高葡萄糖的腎小球膜細胞，基于此，研究者們提出了大黃素對腎功能障礙具有保護作用。此外，大黃素還作用于AMPK/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號傳導，激活自噬，從而保護大鼠腎小管細胞免于凋亡。在Wang 等［14］研究中提示大黃素抑制 p38 MAPK 信號通路激活及下調纖連蛋白表達可能是其保護作用的機制之一。楊秀等［18］研究中從mRNA 和蛋白表達兩個層面證實，大黃素能抑制MMP-2/TIMP-2 的表達，并減少了尿白蛋白的排泄，但還有待于對其機制進一步闡明。

2.6 敏感性分析

為提高研究的穩定性，選擇根據給藥濃度、給藥療程、動物品種的不同把所納入研究的數據進行敏感性分析，進一步評價大黃素的效果。逐一剔除各個研究，觀察其結果并未發生顯著變化，敏感性分析的結論提示：結果較穩定。

2.7 漏斗圖

通過漏斗圖分析大黃素對糖尿病腎病的保護機制的發表偏倚，選擇血糖指標做漏斗圖。圖形顯示：散點分布不對稱，存在一定的發表偏倚，見圖22。

圖22 血糖的發表偏倚結果Fig 22 Publication bias results of blood glucose

3 討論

本研究主要從血糖、SCR、BUN、24 h 尿蛋白量、相對腎重量、TC、TG 等方面評價。結果表明，在調控大鼠的血糖、BUN、Scr 和24 h 尿蛋白方面，大黃素能發揮更佳作用。在亞組分析中，給藥療程對血糖、BUN 的異質性影響較大，這提示療程的不同可能是結果的異質性來源。而血肌酐、24 h 尿蛋白、相對腎重的異質性與大黃素濃度、療程、動物種屬關系不大，這提示可能與老鼠體重、造模方式等造成的異質性有關。

在中國，大黃的使用越來越廣泛，而大黃素作為其重要的單體，結構穩定，功用較多，且機制明確［24］。隨著實驗技術的發展，大黃素治療糖尿病腎病中的機理逐步被揭開了面紗，在調節糖脂代謝，保護腎臟保護中等方面都發揮了及其重要的作用。

大黃素保護腎臟的作用機制可能與以下因素有關：（1）大黃素通過上調nephrin 表達來改善葡萄糖誘導的EMT 及隨后的足細胞功能障礙，足細胞受到保護，因而DN 的進程得到控制。（2）大黃素可促進DN 小鼠腎臟細胞自噬，減輕其腎臟氧化性損傷。大黃素上調了DN 小鼠腎臟P62、Atg7 和 LC3 三種蛋白表達，降低凋亡蛋白Caspase-3 和bax 的表達，并增強凋亡蛋白bcl-2 的水平，腎臟病理性損傷明顯減輕，腎臟ROS 含量顯著降低，而腎臟足細胞自噬程度顯著增強。（3）大黃素可顯著下調磷酸化p38 MAPK 和磷酸化CREB 蛋白的表達，減少纖連蛋白的產生，抑制腎臟肥大、減輕腎小球高濾過、減少蛋白尿、調節脂質代謝紊亂、抑制細胞外基質增加，從而也能延緩腎病的發展。

盡管大黃素的作用機制日益明朗，但尚缺乏實驗及臨床的大量數據，通過動物實驗研究則可獲得可靠的數據資料，亦是探索疾病過程，而基于動物實驗的Meta 分析又將不同的地點，不同學者的研究進一步匯總，統計分析，又可驗證實驗結論，能得到可靠且準確的結論，為臨床藥物的運用、療效的分析提供多中心，大樣本的數據支持。

本次Meta 分析的局限性：（1）納入研究的樣本量普遍較小，導致多項指標存在異質性。（2）大黃素自身特性如純度、聚合度也沒有詳細報道，可能使結果存在一定的偏差。（3） 本次納入的所有研究，其動物模型較單一，排除了其他動物模型如蛙、兔等。綜上所述，大黃素能有效降低患病大鼠的空腹血糖，對大鼠的BUN、Scr、24 h 尿蛋白值也有改善，對糖尿病大鼠早期腎損傷具有一定的保護作用，但仍需要更高質量、更大樣本的研究進一步評價大黃素對腎損傷的保護作用。

作者貢獻度說明：

何望：搜索及篩選相關文獻，數據匯總，統計分析，完成論文的主要撰寫；黃國順：負責文獻的篩選，數據的初步處理；張凱鈺：進行文獻收集，數據的最后匯總，圖表設計；周恩超：提供論文寫作思路，負責初步審稿、修稿及定稿。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。