鵝細小病毒強毒株的分離鑒定與遺傳進化分析

王志強 黃宇翔 鄒躍 張紅 楊昊天 董佳強 楊坤

摘 要：為了了解齊齊哈爾地區鵝細小病毒（GPV）現地強毒株的流行及抗原變異情況，試驗從齊齊哈爾龍江縣某養殖場采集疑似小鵝瘟病死雛鵝的肝脾病料進行病毒分離培養，對獲得的疑似尿囊液進行PCR檢測、血凝性檢測、動物回歸試驗及VP3基因序列分析。結果表明，分離到的病毒株能使12日齡鵝胚在144 h內死亡；血凝性檢測未檢測出血凝價；動物回歸試驗，可復制該病，致使5日齡雛鵝在96～144 h內全部死亡；VP3基因PCR擴增條帶大約為1 600 bp，與目的條帶大小相符；對其進行序列分析，判定該分離株為鵝細小病毒毒株，與我室之前分離鑒定的鵝細小病毒HH10強毒株核苷酸同源性為98.17%，與標準B株核苷酸同源性為97.13%。說明鵝細小病毒基因保守。

關鍵詞：鵝細小病毒；現地株分離鑒定；動物回歸試驗；遺傳進化分析

鵝細小病毒（Goose parvovirus， GPV）易感譜很窄，在自然感染條件下，只感染雛鵝和雛番鴨。感染雛鵝引發的疫病，我們通常稱為小鵝瘟，流行范圍很廣，世界各地均有發生該病的報道。小鵝瘟是一種極烈性傳染病，對20日齡以內的雛鵝，不僅傳染速度快，病死率高，而且越小日齡感染率和病死率越高，甚至可達100%[1]。該病毒感染后可引起雛鵝多器官炎癥，如急性腸炎、肝炎、腎炎等[2]。特征性病變是小腸中下段比正常腸管粗2～3倍，腸道內形成灰白色或淡黃色栓狀凝固物。被感染的雛鵝表現出精神沉郁、食欲不振、嚴重下痢、呼吸困難、角弓反張等癥狀[3]。本病的發生率和死亡率與年齡有很大的相關性，1周齡以內雛鵝感染死亡率達到100%，2～3周齡的雛鵝發病率雖然很高、但死亡率可能低于10%，而4～5周齡雛鵝感染后，造成的損失可能不大，但如果飼養管理不善，繼發其他細菌、真菌或病毒感染，可使最終死亡率大幅上升[4]。

2022年5月，龍江縣某養殖場7日齡雛鵝暴發疑似小鵝瘟疫情，損失非常嚴重。本研究在該養殖場采集疑似鵝細小病毒感染的病料，用鵝胚分離出疑似鵝細小病毒，并通過PCR試驗進行實驗室確診，同時擴增出分離毒株的VP3基因，進行遺傳進化分析，為齊齊哈爾地區鵝細小病毒現地強毒株的流行及抗原變異情況提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 病料

病死雛鵝肝臟、脾臟等組織，均采自黑龍江省龍江縣某養鵝場。

1.2? 毒株與試驗動物

HH10株為本實驗室于2010年自黑河市病例中分離鑒定的鵝細小病毒現地強毒株；FY89、YAN98株為本實驗室分離致弱的鵝細小病毒株；12日齡鵝胚與1日齡雛鵝均為鵝細小病毒非免疫本地鵝蛋孵化，其鵝細小病毒瓊擴（AGP）抗體陰性。

1.3? 主要試劑

2×GoTaq? Green Master Mix，購自Promega公司；磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；DAN凝膠回收試劑盒、pMDTM19-T載體克隆試劑盒、質粒DNA小量純化試劑盒，均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.4? ?病毒的分離培養

采集龍江縣某養殖場疑似暴發鵝細小病毒病死亡雛鵝的肝、脾組織，用研缽研磨，按每克病料加入1 mL生理鹽水的比例稀釋；反復凍融3次后，14 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm濾膜過濾除菌后，取0. 2 mL接種于12日齡鵝胚，置于孵化器中繼續孵化，收取24 h后死亡鵝胚的尿囊液。連傳2代，收取第二代尿囊液，暫命名為LJ22株，-20 ℃保存備用。

1.5? ?病毒PCR鑒定

以Zadori等[5]發表的鵝細小病毒B株核苷酸序列作為參照，應用引物設計軟件oligo6設計出一對鵝細小病毒VP3基因引物，由上海生工工程有限公司合成，引物序列見表1。以F2代及陰性對照的尿囊液DNA為模板，以設計合成的引物作為擴增VP3基因的引物，利用PCR法鑒定病毒。PCR反應體系為50 μL，反應條件為：首先95 ℃預變性5 min；其次95 ℃變性1 min，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共進行30個循環；最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察并記錄結果。

1.7? 血凝特性鑒定

按照文獻[6]方法，采用血凝試驗（HA）測定現地株LJ22的血凝性。

1.8? 動物回歸試驗

將10只1日齡體內檢測無鵝細小病毒抗體的雛鵝，隨機平均分成兩組，一組為攻毒組，一組為空白對照組。5日齡時對攻毒組進行強毒感染，所用強毒為現地株LJ22，攻毒方式為頸部皮下注射，攻毒劑量為0.2 mL/羽，空白對照組與攻毒組攻毒方式和攻毒劑量相同，只是將現地株LJ22強毒換成無菌生理鹽水。隔離飼養，每天觀察雛鵝的發病及死亡情況。

2? 結果與分析

2.1? 病毒分離及PCR檢測結果

將保存備用的病料接種鵝胚并傳代，結果顯示：第一代鵝胚接種后144 h出現死亡，共接種5枚鵝胚，死亡2枚。第二代鵝胚接種后120 h出現死亡，共接種10枚鵝胚，至144 h全部死亡。死亡鵝胚胚體出血明顯，尿囊膜水腫增厚。以F2代病毒尿囊液中的DNA為模板，進行PCR擴增，結果顯示，擴增得到大小約為1 600 bp的目的片段，與預期片段大小相符。結果表明分離病毒為鵝細小病毒。結果見圖1。

2.2? 血凝試驗結果

采用微量法測定現地株LJ22株的血凝性，結果顯示，該分離株不能凝集公雞紅細胞，符合鵝細小病毒沒有血凝性的特點。

2.3? 動物回歸試驗結果

攻毒組雛鵝發病率和死亡率均為100%（5/5），對照組雛鵝未見發病。死亡雛鵝喙發紺，剖檢見鵝細小病毒典型癥狀，即腸道內形成淡黃色栓狀凝固物。結果見圖2。

2.4? 遺傳進化分析結果

測定LJ22株的VP3結構基因序列各堿基隨機分布于整個序列，無缺失和插入，少數發生替換。使用DNAMAN軟件，對LJ22株與強毒株B株和HH10株、弱毒株FY89、YAN98株一起繪制遺傳進化樹（圖3），結果顯示LJ22株與強毒株HH10株親緣關系較近，核苷酸同源性為98.17%；與B株稍遠，為97.13%。與弱毒株YAN98的核苷酸同源性為95.85%，弱毒株FY89為95.66%。

3? 討論

近幾年來在現地服務過程中發現，雖然養殖場對小鵝瘟防控工作都十分重視，但依然有小鵝瘟疫情散在發生，造成很大的經濟損失。所以小鵝瘟雖然在1956年就由我國學者方定一教授分離并命名[2]，但直到今天，防控形勢依然不容樂觀。

鵝細小病毒基因組結構相對簡單，只有兩個主要的開放閱讀框架，位于左側的開放閱讀框編碼兩種非結構蛋白，NS1和NS2，位于右側的開放閱讀框編碼三種結構蛋白，VP1、VP2和VP3[7-9]。鵝細小病毒結構蛋白與病毒的毒力及致病性有關，其中VP3蛋白暴露于病毒粒子表面，約占病毒衣殼蛋白總含量的80%，是主要抗原蛋白，能誘導機體產生保護性抗體來中和病毒，因此，VP3基因在鵝細小病毒研究中具有重要意義[10-13]。

本研究分離到的LJ22現地強毒株與HH10強毒株核苷酸同源性為98.17%，表明鵝細小病毒基因變異相對較少。至今鵝細小病毒只有一個血清型，它們的基因在漫長的歷史演化過程中嚴格保守，不隨時間和地域的不同而發生大的改變[2， 14]，本結果進一步說明鵝細小病毒基因組的這個特點。由于鵝細小病毒結構蛋白VP基因沒有非結構蛋白NS基因保守，相對來講是鵝細小病毒基因組中核苷酸序列最容易出現突變的區域，因此推測LJ22現地強毒株整個基因組變異不大。細小病毒是所有病毒中基因組最小的病毒之一，鵝細小病毒全基因組只有5 000多個核苷酸，為了更加經濟有效的利用，有些核苷酸甚至同時編碼三個蛋白，它們之間不僅相互作用，而且受到彼此制約，鵝細小病毒本身又是DNA病毒，基因組比較穩定，因此不易發生變異[15-18]。由于鵝細小病毒基因組非常小，基因組中的每一個核苷酸都被充分利用，任何重要的核苷酸變化，導致氨基酸發生改變，進而導致編碼的蛋白質發生任何變化，都有可能改變病毒的屬性，從而危及到病毒自身的存亡，這是病毒在其進化過程中所不能允許的[14]。

4? 結論

本研究成功分離鑒定出1株鵝細小病毒現地強毒株LJ22株，并針對其VP3基因進行了序列分析，結果顯示VP3基因僅有個別核苷酸發生改變，雖然鵝細小病毒也在有效免疫的選擇壓力下，但其基因組趨于保守，并未引起強毒株基因組變異，雖未變異，但防控形勢依然不容樂觀。本研究為鵝細小病毒病的流行病學調查提供了一定的參考依據，并為進一步制定鵝細小病毒病的防控方法奠定了基礎。

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