莧黃洗劑的質量控制

高 珊

唐山市婦幼保健院藥劑科，河北 唐山 063000

莧黃洗劑是唐山市婦幼保健院根據多年臨床經驗所得的自制制劑(冀藥制字Z20050596)，該處方由馬齒莧、苦參、黃柏等組成，具有清熱解毒、燥濕祛疹的功效。自獲得批準文號以來，該制劑已治愈上千余人。原質量標準中僅有苦參堿和鹽酸小檗堿的薄層鑒別，未見含量測定方法，存在不足。為有效控制制劑質量，保證用藥安全，本試驗對苦參堿和鹽酸小檗堿的鑒別方法進行了改進，并新增HPLC法同時測定苦參堿和鹽酸小檗堿的含量[1-4]，該方法簡便、準確、重現性好，為該制劑的質量控制提供了保證?，F報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，配備LC-20AT泵、SL-20A 自動進樣器、島津LC solution 色譜工作站(日本島津公司)、SPD-20A紫外可見光檢測器；UV-2501PC紫外可見分光光度計(日本島津公司)；BP211D電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

苦參堿對照品(批號：110805-200005)、鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-200609)，購于中國藥品生物制品鑒定所；莧黃洗劑(批號：200717、200905、201016)由唐山市婦幼保健院制劑室制備(冀藥制字Z20050596)；乙腈為色譜純(天津四友精細化學品有限公司)；水為重蒸餾水；磷酸為分析純。

2 鑒別

2.1 苦參堿 取本品10 mL，加濃氨試液2.5 mL，用氯仿振搖，提取2次，每次15 mL，合并氯仿提取液，過濾，蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取苦參堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇(10∶6∶1∶1)為展開劑，置氨蒸汽飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，噴以改良的碘化鉍鉀試液。在供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙色斑點。表明無干擾，結果如圖1所示。

2.2 鹽酸小檗堿 取本品10 mL，加濃氨試液 2.5 mL，用氯仿振搖，提取2次，每次15 mL，合并氯仿提取液，過濾，蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)為展開劑，置氨蒸汽飽和的展開缸內，預飽和20 min后，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。在供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同的黃色熒光斑點。無干擾，結果如圖2所示。

1、3、5：樣品；2：鹽酸小檗堿；4：陰性圖2 鹽酸小檗堿TLC圖

3 含量測定

3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX EXTEND-C18(2.1 mm×150 mm)，5 μm；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH6.8，v/v=45∶55)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：225 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；苦參堿、鹽酸小檗堿分離度均大于1.5，理論塔板數以鹽酸小檗堿算大于4000。

3.2 溶液制備 標準品溶液：用天平精密秤取鹽酸小檗堿對照品10.6 mg和苦參堿對照品11.6 mg，置于50 mL容量瓶中。用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液：取莧黃洗劑10 mL，加入濃氨水2.5 mL，并用三氯甲烷進行振搖萃取3次，每次15 mL。將萃取液歸并、過濾，濾液蒸干。用甲醇溶解殘渣并放入5 mL容量瓶中，稀釋至刻度，用0.45 μm針式濾器過濾，即得。

陰性樣品溶液：按莧黃洗劑處方構成分別制備不含苦參和黃柏的陰性樣品，按照配制樣品溶液的方式進行操作，即得。

3.3 方法學驗證

3.3.1 專屬性試驗 分別吸取標準品溶液20 μL、樣品溶液20 μL、陰性樣品溶液各20 μL，根據“3.1”項下的色譜條件對3種溶液進樣，如圖3所示，陰性樣品在相應的苦參堿及鹽酸小檗堿處無色譜峰，無干擾。

A.對照品；B.樣品；C.缺黃柏陰性樣品；D.缺苦參陰性樣品；1.苦參堿；2.鹽酸小檗堿圖3 高效液相圖

3.3.2 線性關系考察 分別精密吸取“3.2”項下標準品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL，放入10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖晃至均勻，即得。根據“3.1”項下的條件進樣，記下色譜圖并測定峰面積。以標準品濃度(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標畫出標準曲線，并用最小二乘法線性回歸分析對曲線進行矯正，得苦參堿和鹽酸小檗堿的回歸方程式：Y=1.7585×104X+2，275×103，r=0.9999；Y=4.0506×104X+5.825×103，r=0.9996結果表明，苦參堿濃度在11.6～174 μg·mL-1、鹽酸小檗堿濃度在10.6～159 μg·mL-1范圍內與峰面積有良好線性關系。

3.3.3 精密度試驗 精密吸取標準品，根據“3.1”項下的條件進樣，持續進樣6次，以計算苦參堿峰面積RSD為0.76%和鹽酸小檗堿峰面積RSD為1.08%，說明此方式具有優良的精密性。

3.3.4 穩定性試驗 取相同樣品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣，得苦參堿和鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為0.82%、1.32%，在2%范圍內，說明溶液在24h內處于穩定狀態。

3.3.5 重復性試驗 取同一批次莧黃洗劑樣品6份(批號：200717)，根據“3.2”項制成樣品溶液，根據“3.1”項條件進樣，測得苦參堿平均含量為77.2 μg·mL-1，RSD為1.22%(n=6)；鹽酸小檗堿平均含量為59.85 μg·mL-1，RSD為1.78%(n=6)。結果表明該方法重復性良好。

3.3.6 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量樣品6份(批號：200717)，每份5 mL，分別按低、中、高3個濃度加入苦參堿和鹽酸小檗堿對照品適量，根據“3.2”項制成樣品溶液，根據“3.1”項條件進樣，記下實驗數據，測得苦參堿平均加樣回收率98.66%、RSD值1.16%，鹽酸小檗堿平均加樣回收率98.09%和RSD值1.10%。符合《中國藥典規定范圍》，表明該方法測得含量準確、可靠。

3.3.7 樣品含量測定 取莧黃洗劑3批次，每批3份，根據“3.2”項制成樣品溶液，進樣并進行含量測定，外標法計算，結果見表1。

表1 樣品含量測定結果 (μg·mL-1，n=3)

4 討論

質量標準是控制藥物制劑質量的基本，只有質量標準的不斷完善與提升，才能更加安全、有效地控制制劑質量。莧黃洗劑的原質量標準檢測項目較少，不能滿足現行質量要求，故本試驗完善莧黃洗劑的質量控制，制定更加科學合理的質量標準。

本試驗參考相關文獻，對比了以甲苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)和苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇(10∶6∶1∶1)為展開劑對苦參堿鑒別的影響，結果甲苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)為展開劑時，斑點不太清晰；甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)為展開劑時，展開后現象不明顯；以苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇(10∶6∶1∶1)為展開劑，斑點清晰，展開效果好，且重現性好。

苦參堿和鹽酸小檗堿的含量測定方法有HPLC、毛細管電泳、紫外分光光度法等[5-9]，尋找一種高效、便捷、穩定的檢測方法，對實際生產研發工作有重要意義。毛細管電泳、紫外分光光度法靈敏度低、易受其他成分影響、分離重現性差；HPLC法分離速度快、重復性高、分析精確度高，故本試驗選擇使用HPLC法同時測定苦參堿及鹽酸小檗堿含量。

苦參堿及鹽酸小檗堿均為生物堿，在堿性溶液中處于游離狀態，能很好地溶于非極性溶劑，因此加入濃氨水堿化樣品。參考相關文獻[10-11]選擇甲醇、75%甲醇和三氯甲烷作為提取劑，結果表明苦參堿及鹽酸小檗堿均能很好地被三氯甲烷萃取，故選擇三氯甲烷為提取劑。

對苦參堿和鹽酸小檗堿標準品分別在200～400 nm下進行光譜掃描，結果顯示苦參堿在220 nm處有強吸收，而鹽酸小檗堿在227 nm和265 nm處均有強吸收。為提高檢測靈敏度，使兩組分在同一波長下均有較好吸收且無干擾，故選擇225 nm為檢測波長。經試驗證實，在此波長下，苦參堿和鹽酸小檗堿分離良好，保留時間充足。

本試驗參考相關文獻[12-13]，選擇乙腈-磷酸鹽緩沖液為流動相，考慮到HPLC條件對試驗結果產生的差異，分別考察了不同流動相比例(35∶65、45∶55)、不同流速(1.0 mL·min、1.5 mL·min)和不同pH值(pH6.8、pH7.4)下兩種成分的出峰時間，結果發現乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH6.8，v/v=45∶55)，流速：1.0 mL·min-1，分離效果和峰形更好，保留時間適中，基線穩定。

5 小結

莧黃洗劑為治療火熱毒邪發于肌表皮膚所出的斑疹而設。全方以苦參清熱燥濕為君；黃柏瀉火解毒為臣?？鄥⒅饕锌鄥A、氧化苦參堿、黃酮類等有效成分，黃柏主要含有鹽酸小檗堿、黃柏堿等。本試驗采用薄層色譜法對莧黃洗劑中苦參堿和鹽酸小檗堿進行定性鑒別，專屬性高、呈現性好；采用高效液相色譜法同時測定苦參堿和鹽酸小檗堿的含量，結果準確、可靠。優化了莧黃洗劑的質量標準，節約了時間，簡化了試驗步驟，為更好地控制莧黃洗劑的質量提供了科學、可靠的依據，可用于該制劑的工業生產。