基于轉錄組學數據探討針刺“足三里”或“內關”改善潰瘍性結腸炎的腧穴功效差異＊

董龍聰，張瑞斌，沈 緣，李虹瑩，黃 琴，余曙光，吳巧鳳

（成都中醫藥大學針灸推拿學院 成都 610075）

傳統中醫理論認為，腧穴功效除具有相對特異性外，同時還具有整體調節效應，表現出一定的共性特點。例如，足三里是下合穴，其主要功能是調理胃腸道功能，但在治療心血管類疾病時，足三里也是一個高頻使用的穴位[1]；內關是手厥陰心包經之絡穴，其功能主要是寧心安神、理氣止痛，但治療胃腸道疾病時，由于是八脈交會穴，也會調氣機，安脾胃[2]。因此古人將這兩個腧穴的特異性功效概括為“合治內腑”或“內關心胸謀”，而又將其功效的多面性概括為“足三里諸病皆治”或“內關可活一身之血脈瘀滯”。但是，這些論述背后具體的現代原理及其相關生物學機制還不清楚。20世紀70年代以來，研究者在動物身體上的不同區域進行刺激，可以特異性地誘導自主神經反射調節機體功能，如針刺“足三里”穴位能通過迷走神經介導作用促進胃腸運動，而針刺刺激腹部“天樞”穴位能抑制胃腸運動（交感神經介導為主）。2020 年，研究證實，用電針刺激足三里和天樞穴都能緩解小鼠的炎癥因子風暴，但足三里只需要用0.5 mA 的低強度刺激就能激活從迷走神經到腎上腺的抗炎通路，起到治療效果，而且無論是患病前預先刺激還是患病后再刺激，都有正面效果；但低強度刺激天樞穴無法激活以上抗炎通路，必須達到1-3 mA 的高強度刺激才能通過激活交感神經通路發揮抗炎作用[3]。后續有研究指出，是否表達Prokr2 基因的背根神經節（Sorasal root ganglion，DRG）感覺神經元是造成足三里和天樞穴上述不同抗炎結局的重要機制，從神經解剖學角度為穴位的相對專一性或特異性做出了進一步的科學解釋[4]。結合上述研究的結論不難發現，足三里和內關兩個穴位由于均分布在機體四肢，因此具有一定的共性，同時由于它們分別與迷走神經和交感神經關系密切，在功效上可能又各有特點，但是兩者在功效的微觀層面上到底有何差異，其功效特點與病變部位是否有關聯等問題仍然值得進一步研究。因此，本研究將利用轉錄組測序技術，以硫酸葡聚糖鈉鹽（Dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導的潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）小鼠模型為載體，研究針刺“足三里”或“內關”對于病變部位結腸及非病變部位心臟的基因變化，從病變和非病變組織的轉錄組學等生物信息學角度，為闡釋兩個腧穴功效的相似性和差異性提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

無特定病原體級雄性C57BL/6J 小鼠36 只，體質量26±2 g，均購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司（動物生產許可證號：SCXK（川）2020-034）。動物飼養于小鼠獨立通氣籠盒，室溫23±2℃，12 h 明暗交替，小鼠自由飲食、飲水。本實驗已獲得成都中醫藥大學倫理委員會的批準（2019-04），并嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規定進行實驗操作。

1.2 主要試劑與儀器

DSS（9011-18-1，MP Biomedicals），聯苯胺（92-87-5，上海阿達瑪斯試劑有限公司），一次性針灸針（北京中研太和醫療器械有限公司），4%多聚甲醛通用型組織固定液（G1101，武漢賽維爾生物科技有限公司），蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色）（G1076，武漢賽維爾生物科技有限公司），全長轉錄組測序平臺（英國Oxford Nanopore Technologies），2015 石蠟切片機（德國Leica），HS6 病理切片掃描儀（舜宇光學科技（集團）有限公司）。

1.3 造模與干預方法

C57BL/6J小鼠適應性喂養1周后隨機分為空白組9 只、造模組27 只。通過自由飲用2.5%濃度的DSS 7天的方式對造模組進行造模[5]。判定造模成功的方法為：造模第5天，對比觀察空白組與造模組小鼠體質量下降情況，采集兩組小鼠新鮮糞便，比較糞便情況，根據聯苯胺隱血檢測說明，比較兩組小鼠糞便隱血情況。以小鼠出現體質量下降、糞便松散或稀便及糞便隱血試驗陽性為造模成功的標準[6]。在第5 天按照體質量區間分組法隨機分為模型組、足三里組和內關組。足三里組及內關組從造模第5 天開始進行干預，模型組和空白組只捆綁固定，不予其它干預。依據《實驗針灸學》[7]中“常用動物穴位及圖譜”的小鼠“足三里”和“內關”定位進行針刺干預。具體方法為：足三里穴位于膝關節下方，腓骨小頭下0.3 cm 處的肌溝中；內關穴位于前肢內側，腕關節上方0.3 cm 處的橈、尺骨間。分別于上述穴位針刺至肌層，留針30 min，每天1次，連續針刺干預5天。

1.4 觀察指標及檢測方法

小鼠一般狀態觀察、DAI 評分[6]：每日記錄小鼠體質量變化，并觀察各組小鼠的自主活動、毛發色澤及精神狀態變化。每次干預結束后，采集各組小鼠新鮮糞便觀察糞便質地、性狀并檢測糞便隱血。同時，依據DAI計算公式，計算各組的DAI評分。

HE 染色觀察各組小鼠結腸組織形態學變化：干預結束后，將各組小鼠脫頸處死，截取盲腸遠端到肛門1 cm 的全部腸段。生理鹽水沖洗腸內容物后，放置于4%多聚甲醛組織固定液中固定48 h。常規石蠟包埋切片，厚度4 μm，二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗脫，HE染色，封片，病理切片掃描儀掃描。

全長轉錄組測序：干預結束后，取小鼠新鮮結腸及心臟組織經液氮速凍后，置于干冰中送至北京百邁客生物科技有限公司進行全長轉錄組測序分析。實驗流程按照Oxford Nanopore Technologies 公司提供的標準步驟執行：提取總RNA，合格樣品上機檢測，通過引物擴增、退火，反轉錄成cDNA，通過switch oligo，合成互補鏈，DNA 損傷修復和末端修復，磁珠純化等步驟完成文庫構建并連接測序接頭，上機測序。

生物信息學分析：使用“DESeq2”包分析各組間的差異表達基因（Differential expressed genes，DEGs），DEGs 的篩選條件為|log2（fold change）|>2，P<0.01[8]。使用基因本體論（Gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫進行功能富集分析[9-11]。

1.5 統計學處理

采用R 3.6.3 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。DAI 評分采用Kruskal-Wallis Test，組間兩兩比較選用Dunn's Test。以P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 針刺干預效應觀察

2.1.1 各組小鼠一般狀態和DAI評分比較

造模開始后小鼠精神逐漸變差，毛發無光，進食少，體質量明顯減輕，于第3 天開始陸續出現肛門污穢，可見血便，糞便隱血試驗為陽性；針刺足三里或內關后，兩組小鼠均較模型組精神狀態好，進食逐漸增多，體質量恢復，糞便隱血實驗由陽性轉為弱陽性或陰性。DAI 評分顯示，模型組DAI 評分明顯高于空白組（P<0.001），差異有統計學意義；與模型組相比，足三里組及內關組DAI 評分明顯降低（P<0.05），差異有統計學意義，且足三里組與內關組組間差異無統計學意義（P>0.05）（見圖1）。

圖1 各組干預后DAI評分比較（±s，n=9）

2.1.2 各組小鼠結腸組織形態比較

HE 染色結果顯示，空白組小鼠結腸上皮結構完整，杯狀細胞數量豐富且無炎性細胞浸潤。模型組結腸上皮結構破壞明顯，杯狀細胞大量減少并伴有炎性細胞的大量浸潤。足三里組、內關組較模型組結腸損傷均有明顯改善（見圖2）。

圖2 各組小鼠結腸組織形態結構比較（HE染色，×100倍）

2.2 結腸組織RNA-Seq結果分析

2.2.1 差異基因分析

與空白組相比，模型組有1420個基因上調，796個基因下調；足三里組對比模型組有537 個基因上調，770 個基因下調；內關組對比模型組有650 個基因上調，945 個基因下調。聚類結果顯示，各組的整體基因表達模式有明顯差異（見圖3）。

圖3 各組樣本差異基因的火山圖和聚類熱圖（n=3）

為了進一步分析針刺“足三里”“內關”對于DSS模型干預后基因表達差異，對模型組vs.空白組、足三里組vs.模型組的差異基因取交集，獲得具有相反表達趨勢的共表達基因993 個。類似地，對模型組vs.空白組、內關組vs.模型組的差異基因取交集，獲得具有相反表達趨勢的共表達基因1150 個。進一步將上述兩個基因集進行Venn分析，篩選出有相同表達趨勢差異基因（Common differential expressed genes，co-DEGs）共825 個，足三里組特有差異基因（ST36 only differential expressed genes，ST36 only-DEGs）共168個，內關組特有差異基因（PC6 only differential expressed genes，PC6 only-DEGs）共325個（見圖4）。

圖4 差異基因Venn圖

2.2.2 差異基因富集分析

為了進一步明確co-DEGs、ST36 only-DEGs 及PC6 only-DEGs 三個基因集的功能異同，對其進行了GO 富集分析。結果發現，針刺兩個穴位的co-DEGs主要富集到與炎癥相關的白細胞遷移、細胞趨化性等條目，反映了針刺兩個穴位均具有一定程度的抗炎作用。但分開來看，針刺兩個穴位影響的生物過程存在差異（見表1）。

表1 不同針刺干預方式后各組差異基因GO富集分析結果（結腸組織）

接下來，在KEGG 通路富集分析中，co-DEGs富集到IL-17 信號通路、TNF 信號通路、細胞因子和細胞因子受體的相互作用等通路；ST36 only-DEGs 富集到緊密連接、鈣信號通路、cAMP 信號通路、磷酸肌醇代謝等通路；PC6 only-DEGs 富集到細胞因子-細胞因子受體相互作用、JAK-STAT 信號通路等。為了更全面地分析三個基因集在KEGG 通路富集上的區別，將三個基因集富集到的KEGG 通路進行歸類，結果發現在co-DEGs 的KEGG 通路富集歸類中，人類疾病中的感染性疾病占比最高（28.57%），同時免疫系統也具有較高的占比（23.81%）。ST36 only-DEGs 的KEGG 通路富集歸類分析結果顯示最主要改變的通路類型為免疫系統（26.67%）及內分泌系統（20%）。PC6 only-DEGs 的KEGG 通路富集歸類分析結果顯示最主要改變的通路類型是信號轉導通路（38.46%）。同時，使用 Cytoscape 中的ClueGO 篩選三個差異基因集中的核心KEGG通路，co-DEGs篩選出的核心通路包括IL-17信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、Toll 樣受體信號通路等，ST36 only-DEGs 篩選出的核心通路包括胃酸分泌、磷酸肌醇代謝等，PC6 only-DEGs 篩選出的核心通路包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、HIF-1信號通路等（見圖5）。

圖5 各組差異基因KEGG富集分析

2.3 心臟組織RNA-Seq結果分析

2.3.1 差異基因分析

與空白組相比，模型組有224 個基因上調，203 個基因下調；足三里組對比模型組有137 個基因上調，108 個基因下調；內關組對比模型組有138 個基因上調，151 個基因下調。聚類結果顯示，各組的整體基因表達模式有明顯差異（見圖6）。

圖6 各組樣本基因的火山圖和聚類熱圖（n=3）

為了進一步分析針刺“足三里”“內關”對于DSS模型干預后基因表達差異，對模型組vs.空白組、足三里組vs.模型組的差異基因取交集，獲得具有相反表達趨勢的共表達基因123個。類似地，對模型組vs.空白組、內關組vs.模型組的差異基因取交集，獲得具有相反表達趨勢的共表達基因209個。進一步將上述兩個基因集進行Venn 分析，篩選出co-DEGs 共95 個，ST36 only-DEGs共28個，PC6 only-DEGs共114個（見圖7）。

2.3.2 差異基因富集分析

為了進一步明確co-DEGs、ST36 only-DEGs 及PC6 only-DEGs 三個差異基因集的功能異同，對其進行了GO 富集分析。結果顯示，在心臟中，針刺兩個穴位的co-DEGs 主要富集到與炎癥相關的防御反應等條目，一定程度反映了針刺兩個穴位正在非病變部位仍發揮了抗炎功能。但分開來看，針刺兩個穴位影響的生物過程有一定的區別（見表2）。

表2 不同針刺干預方式后各組差異基因GO富集分析結果（心臟組織）

接下來，在KEGG 通路富集分析中，co-DEGs富集到TNF 信號通路、IL-17 信號通路等；而ST36 only-DEGs 未能富集到通路；PC6 only-DEGs 則富集到蛋白質消化吸收、金黃色葡萄球菌感染等通路。為了更全面地分析三個基因集在KEGG 通路富集上的區別，將三個基因集富集到的KEGG 通路進行歸類。發現在co-DEGs 的KEGG 通路富集歸類中，人類疾病中的感染性疾病占比最高（36.36%）。PC6 only-DEGs 的KEGG 通路富集歸類分析結果顯示人類疾病中的感染性疾病也有較高的占比（18.42%），此外還發現了心血管疾病相關的通路被富集（2.63%）（見圖8）。

圖8 各組差異基因KEGG富集分析

將上述結果進一步歸納整理，可以看出無論是針刺足三里還是內關，其對結腸組織的主要影響涉及感染和免疫系統，包括白細胞遷移、炎性相關的IL-17、TNF、Toll 通路等，對心臟組織的主要影響仍然與炎癥和提高機體防御反應相關；但是在這種共性基礎上，針刺足三里對結腸組織的影響還涉及趨化因子活性、鈣信號通路、磷酸肌醇代謝等與內分泌系統相關的通路，針刺內關穴與信號轉導通路更為密切，而對非病變組織心臟而言，針刺足三里沒有富集到其它核心基因，而針刺內關雖然富集到與心血管相關的核心基因，但也只有不足3%的比例（見表3）。

表3 不同組織基因富集結果歸納表

3 討論

本研究的目的是探討不同腧穴功效是否存在特異性和共性。以往大量的研究表明，腧穴功效存在相對特異性，“合治內腑”和“內關心胸謀”等臨床經驗的總結，一定程度上反映了腧穴功效的特異性，這也是臨床合理選穴和提升療效的重要基礎。但是不難發現，除了這種特異性，對機體整體或綜合性的調節也是針灸作用的一大特點，是針灸發揮“多靶點、多層次、多水平”綜合作用的基礎。因此，深刻認識腧穴功效所具有的相對特異性和復雜多樣的整體調節作用就成為揭示針灸作用基礎的重要途徑?，F代生物學技術，如系統生物學以及各種組學技術的發展，為我們從宏觀與微觀相結合的角度揭示腧穴功效的特點提供了便利。在DSS 造模的UC 小鼠模型中，一般認為不會對心臟組織造成損傷（非病變部位）。同時，代謝組學研究[12]顯示DSS 誘導的UC 模型對心臟代謝功能存在一定程度的影響，這可能也是本研究中轉錄組學發生變化的主要原因。因此，通過比較不同腧穴（足三里與內關）對于潰瘍性結腸炎治療中的病變部位（結腸）和非病變部位（心臟）所產生的不同變化并探討腧穴功效異同的潛在機制。本研究采用轉錄組學測序的方法對針刺足三里與內關影響UC 小鼠結腸和心臟組織進行了較為細致的比較研究，初步發現：①針刺兩個穴位均能改善UC 小鼠的一般狀況和結腸炎性癥狀；②從轉錄組測序分析結果來看，針刺足三里和內關無論對病變組織結腸，還是對非病變組織心臟均存在較多的共性調節基因，主要富集在免疫、抗炎等方面；但與非病變組織相比，無論針刺哪個穴位都對病變組織的影響更大，共變基因更多，富集到的抗炎相關通路也更多；③對病變組織，針刺足三里和內關均涉及感染和免疫系統，但足三里組主要影響的是免疫和內分泌相關的基因和信號通路，而內關組主要影響的是信號轉導通路，兩者有細微差別。

《靈樞經》言“合治內腑”[13]，指出下合穴對于相應臟腑有特異性的靶向治療作用。足三里為胃之下合穴，故有“邪在脾胃……皆調于三里”闡釋了足三里對于胃腑疾病的特殊治療作用[13]。又因“大腸、小腸，皆屬于胃”，故足三里的特效作用不僅僅拘泥于胃腑疾病，如“腸中寒，脹滿，善噫……三里主之”“霍亂遺矢氣，三里主之”等條文所述，胃腸二腑位置相近、功能相關，且經脈相連、經氣相通，所以足三里對于腸腑疾病也具有靶向作用[13-14]。內關作為手厥陰心包經絡穴，“諸邪之在于心者，皆在于心之包絡”，心與心包原為一體，脈氣相通，因心“其臟堅固,邪弗能容也”，心包代心受邪，故內關主治心系疾病[13]?！靶南祵崉t心痛，虛則為煩心，取之兩筋間也”則強調了內關對心臟病變具有靶器官治療效應[13]。此外，內關為八脈交會穴，通陰維脈，而陰維脈與沖脈通過足太陰脾經、足陽明胃經和足少陰腎經的連屬關系，相合于胃、心、胸部，疏利三焦氣機，故也常常用于胃腸消化疾病的治療[15]。相關研究也證實內關可以有效降低胃腸道疾病的炎癥反應，降低胃腸道敏感性以改善胃腸功能[16-17]。上述中醫理論為足三里或內關治療胃腸道疾病提供了依據，與臨床實踐也非常相符。本研究從轉錄組測序的角度，初步證實了針刺“足三里”與“內關”在DSS 誘導的UC 小鼠模型均能通過調整機體的細胞因子、趨化因子發揮對UC 抗炎“同”的功效。而“足三里”在結腸組織中具有特異性調整作用，“內關”在心臟組織中對于心血管具有靶向作用，這一定程度體現了二穴對于靶器官的“異”的功效。

綜上，本研究從轉錄組學角度證實腧穴功效除具有相對特異性外，同時還表現出一定的共性特點。但是，本研究僅僅從針刺的末端（即效應器官）入手，并沒有涉及上游神經支配或中樞調控等路徑，未來還需要對產生腧穴功效“同”與“異”的具體機制進行深入的研究。