從“濕熱致瘀”角度探討幽門螺旋桿菌感染對慢性萎縮性胃炎Hedgehog及NOX/NF-κB/STAT1信號通路的影響＊

徐曉惠，閆海琳，徐子萱，周姝含＊＊，呂文亮＊＊

（1.桐鄉市第一人民醫院 桐鄉 314500；2.湖北中醫藥大學中醫臨床學院 武漢 430061）

胃癌可分為兩種亞型，較多見的是由萎縮性胃炎和腸上皮化生演變而來即遵循Correa發展模式的腸型胃癌。幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是我國胃癌的最主要原因，存在Hp 感染的萎縮性胃炎（Chronic atrophic gastritis，CAG）患者是腸型胃癌的高危人群，Hp 陽性的輕/中度萎縮和重度萎縮患者比Hp陰性患者的胃癌發病率高6.4 倍和11.8 倍[1]。由于炎癥可控，而癌癥難控，對包括CAG 在內的Hp相關性胃癌前病變的早期管理成了胃癌防控的著力點，對Hp相關性CAG的“炎癌轉化”機制研究顯得尤為重要。

目前，Hp 相關性CAG 的“炎癌轉化”機制的相關研究中，在哺乳動物體內刺猬蛋白-細胞表面受體Ptch-G 蛋白偶聯受體樣蛋白Smo-膠質瘤相關癌基因同源蛋白Gli（Hh-Ptch-Smo-Gli）構成的信號通路（Hedgehog信號通路）異?；罨徽J為與CAG 的“炎癌轉化”有關[2]。膠質瘤相關癌基因同源蛋白1（Gli1）在核內促發Shh下游靶基因和自身Gli基因的轉錄，誘導DNA 的異常復制而導致腫瘤發生[3]，在包括胃癌在內的多種癌癥中，均出現Hh-Ptch-Smo-Gli 通路的過度激活[4]。

此外，炎癥因子的釋放與“炎癌轉化”密切相關，NADPH 氧化酶（NOX）作用是在免疫防御中產生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），抑制病原體入侵[5]，腫瘤細胞發育過程中會產生過量的ROS[6]，促進腫瘤新生血管的生成，誘發或啟動包括炎癥和腫瘤在內的多種疾病[7-9]。NF-κB 信號通路與機體炎癥因子的釋放，腫瘤的發生、生長和轉移等多個過程密切相關[10]。轉錄信號轉導子和轉錄活化子1（Signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）被認為是一個抑癌因子，可促腫瘤細胞凋亡[11]，并可調控NF-κB 轉錄因子的表達[12]，且NF-κB 和STAT1 信號通路的激活受ROS信號調控[13]。NF-κB/STAT1信號通路在萎縮性胃炎“炎癌轉化”過程中可能發揮著不可忽視的作用。

從中醫辨證的角度而言，Hp被認為是一種濕熱性質的病邪，Hp 感染與脾胃濕熱證關系最密切，因為飲食失節等使脾胃受損，濕熱內生，更利于Hp 的定植，感染人體后造成黏膜損傷又會進一步加重“濕熱證”，課題組前期進行了慢性胃炎的病機轉化規律研究，發現脾胃濕熱-胃絡瘀血的病機轉化位于慢性萎縮性胃炎腺體萎縮-腸化生的關鍵節點。濕熱不去而釀毒損絡成瘀，胃黏膜病變漸生，瘀血與濕熱蘊結，久化瘀毒，瘀血證的出現常被認為是黏膜惡變的重要標志。

因此，本研究著眼于Hp 相關性CAG 和非Hp 感染的CAG 患者，運用蛋白質免疫印跡（Western blot）和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測其胃黏膜中Hh-Ptch-Smo-Gli信號通路與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶/核因子κB/轉錄信號轉導子和轉錄活化子1（NOX/NF-κB/STAT1）通路的關鍵因子，從濕熱致瘀角度探究Hp感染后CAG“炎癌轉化”的作用機制。

1 研究對象與方法

1.1 患者來源及分組

患者來源于2021 年8 月-2021 年12 月湖北中醫藥大學附屬湖北省中醫院脾胃病科CAG 患者，分為CAG 伴Hp 感染組（HP+CAG 組，n=21）與CAG 不伴Hp感染組（HP-CAG組，n=22）。

1.2 診斷標準

參考《慢性萎縮性胃炎中西醫結合診療共識意見（2017 年）》[14]、《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》[15]、《成人幽門螺桿菌引起的胃炎中西醫協作診療專家共識（2020，北京）》[16]，根據臨床癥狀、胃鏡、病理活檢、尿素呼氣試驗、快速尿素酶試驗或Hp 培養等結果診斷。

1.3 倫理委員會批準

本研究經湖北省中醫院倫理委員會批準（HBZY2021-C15-01）。參與者均詳細了解此項研究內容及相關權利后簽署知情同意書。

1.4 胃黏膜樣本采集

胃鏡下使用一次性活檢鉗取約1 mm×1 mm×1 mm的距幽門2-3 cm 胃竇臨近胃小彎一側的黏膜組織3 塊，其中2 塊分別放入無菌的凍存管內，迅速投入液氮中凍存，后存放于-80℃冰箱保存備用，另1 塊使用4%多聚甲醛以固定組織，常溫保存，后以石蠟包埋、切片備用。

1.5 RT-qPCR引物序列

具體引物序列見表1。GAPDH 表達做內部參照，使用PCR 儀分析cDNA，并繪制溶解曲線，以QPCR 算法（相對定量，2-ΔΔCt法）進行數據分析。QPCR 算法公式：

表1 引物序列表

1.6 數據分析

實驗數據采用SPSS 25.0軟件進行統計分析，計數資料采用百分比表示，計量資料以平均值±標準差（±s）表示。兩組間的差異比較，若方差齊，采用T檢驗（Student'st-test）；若方差不齊，采用Wilcox 秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test），多組間均數行單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 研究對象分組情況基本資料

Hp+CAG 與Hp-CAG 組患者性別比例與年齡無統學差異（P>0.05），具體可見表2。

表2 研究對象分組情況基本資料（±s）

表2 研究對象分組情況基本資料（±s）

組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）性別男（n）11（52.4%）10（45.5%）女（n）10（47.6%）12（54.5%）年齡（歲）54.33±6.79 51.89±7.24

2.2 兩組患者胃黏膜病理表現

胃鏡下觀察兩組患者胃黏膜紅白相間、以白為主，粘膜變薄或粗糙不平，其中可見血管紋理，或伴有點、片狀紅斑或散在出血點，部分患者可見黏膜水腫。

蘇木精-伊紅（HE）染色后，在鏡下觀察各組患者黏膜組織病理情況，結果顯示：Hp+CAG組患者胃黏膜出現上皮細胞部分脫落，腺體數量減少，排列紊亂，可見明顯腸上皮化生及炎癥細胞浸潤；Hp-CAG 組患者胃黏膜腺體數量減少，排列紊亂，局部可見腸上皮化生，炎癥細胞浸潤程度較Hp+CAG組輕（見圖1）。

圖1 各組患者胃黏膜組織HE染色（×200）

圖2 兩組蛋白相對表達量

參照慢性胃炎新悉尼系統對胃黏膜炎癥程度和活動度進行分級（見表3，表4），統計兩組患者胃黏膜出現不同程度和活動度炎癥的例數并進行統計學分析。結果表明，Hp+CAG 組患者胃黏膜均出現不同程度的炎癥，且出現重度炎癥的比例明顯高于Hp-CAG組（P<0.05）；輕度或無炎癥患者的比例低于Hp-CAG組（P<0.05）；兩組患者中胃黏膜出現中度炎癥的比例相當，差異沒有統計學意義（P>0.05）。Hp+CAG 組患者胃黏膜出現重度和中度炎癥活動度的比例明顯高于Hp-CAG 組（P<0.05）；而出現輕度或無炎癥活動度的比例明顯低于Hp-CAG組（P<0.05）。

表3 兩組患者胃黏膜炎癥程度分級

2.3 RT-qPCR檢測結果

經數據分析發現，兩組患者胃黏膜Gli1 mRNA、Gli2 mRNA、Gli3 mRNA 水平有顯著差異（P<0.01）（見表5）。兩組患者胃黏膜Shh mRNA、Smo mRNA、Ptch mRNA差異具有統計學意義（P<0.01）（見表6）。兩組患者胃黏膜NOX1 mRNA、NOX2 mRNA、NOX4 mRNA 與NFκB mRNA差異具有統計學意義（P<0.01）（見表7）。

表5 兩組患者胃組織Gli1、Gli2、Gli3 mRNA檢測結果（±s）

表5 兩組患者胃組織Gli1、Gli2、Gli3 mRNA檢測結果（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

Gli3 1.056±0.050 0.438±0.008**組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）Gli1 1.046±0.040 2.700±0.017**Gli2 0.985±0.048 0.463±0.011**

表6 兩組胃組織Shh、Smo、Ptch mRNA檢測結果（±s）

表6 兩組胃組織Shh、Smo、Ptch mRNA檢測結果（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

Ptch 1.052±0.045 2.719±0.026**組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）Shh 1.089±0.077 2.863±0.025**Smo 1.050±0.043 2.717±0.023**

表7 兩組胃組織NOX1、NOX2、NOX4、NF-κB mRNA檢測結果（±s）

表7 兩組胃組織NOX1、NOX2、NOX4、NF-κB mRNA檢測結果（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）NOX1 NOX2 NOX4 1.068±0.059 NF-κB 0.981±0.047 0.987±0.045 1.060±0.052 0.502±0.007**0.504±0.007**0.458±0.006**0.452±0.006**

2.4 Western blot檢測結果

兩組患者胃黏膜NOX1/GAPDH、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH 相對表達量差異具有統計學意義（P<0.01）（見表8）。兩組患者胃黏膜p-P65/GAPDH 相對表達量、STAT1/GAPDH 相對表達量差異具有統計學意義（P<0.01）；兩組P65/GAPDH 相對表達量的差異沒有統計學意義（P>0.05）（見表9）。

表8 兩組NOX1/GAPDH、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH相對表達量（±s）

表8 兩組NOX1/GAPDH、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH相對表達量（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

NOX4/GAPDH 0.800±0.054 0.474±0.094**組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）NOX1/GAPDH 0.757±0.139 0.393±0.114**NOX2/GAPDH 0.561±0.073 0.231±0.029**

表9 兩組STAT1/GAPDH、P65/GAPDH、p-P65/GAPDH相對表達量（±s）

表9 兩組STAT1/GAPDH、P65/GAPDH、p-P65/GAPDH相對表達量（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

p-P65/GAPDH 0.599±0.163 0.265±0.149**組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）STAT1/GAPDH 0.134±0.091 0.466±0.115**P65/GAPDH 0.851±0.055 0.780±0.078

3 討論與結論

本次研究重點觀察了幽門螺旋桿菌感染對慢性萎縮性胃炎患者胃黏膜炎癥程度的影響，顯而易見，Hp 感染明顯加重了CAG 患者胃黏膜炎癥程度，與此同時，Hp 感染后NOX/NF-κB 信號通路的異常激活及Hh-Ptch-Smo-Gli 信號通路的抑制，使“炎癌轉化”風險增加。

Hp+CAG組患者胃黏膜出現中度及重度炎癥的比例明顯高于Hp-CAG 組，提示Hp 感染明顯加重了CAG 患者胃黏膜炎癥程度。有報道稱輕度、中度及重度胃黏膜炎癥患者的Hp 感染率逐漸升高[17]。Correa's Cascade 相關胃黏膜病變（包括萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生和胃癌）中Hp 感染率均高于非萎縮性胃炎組（P<0.01），且胃黏膜病變程度隨著Hp感染程度分級的增加而增加[18]，說明胃黏膜病變程度與Hp感染程度有關。

Hp通過釋放尿素酶來中和胃內的酸性環境，在胃中長期存活[19]，同時利用鞭毛和趨化受體在胃黏膜上皮細胞定植，導致炎癥和中性粒細胞浸潤[20-21]。此外，Hp憑借其毒力因子細胞毒素相關蛋白A（CagA）、空泡毒素A（VacA）等，干擾宿主細胞內信號通路，導致胃黏膜長期慢性炎癥，參與CAG 發生發展，驅動“炎癌轉化”[22-23]。例如，CagA 在感染的細胞中激活NF-κB 依賴的炎癥信號傳導，促進白細胞介素-8（IL-8）的產生[24-25]，導致中性粒細胞和巨噬細胞的招募，聚集的中性粒細胞、單核巨噬細胞會產生大量的NOX2，繼而生成過量的ROS[26]。由于Hp 菌體內含有各種超氧化物還原酶，具有較強的抗氧化能力，更關鍵的是，Hp會破壞NOX 的靶向性[27]，使超氧陰離子釋放到細胞外環境中，而不會在Hp 吞噬體內積累，所以Hp 感染導致的NOX2 異?；罨?，只會加速胃黏膜的氧化損傷而不影響Hp 的繼續定植。故宿主對其的氧化殺傷往往失敗，結果Hp 感染持續存在，而ROS 生成和釋放持續增多，導致胃黏膜上皮細胞持續損傷[28]。

NOX 的過度激活是導致氧化應激水平升高的重要機制，其中NOX2 在人胃黏膜的表達與胃黏膜的炎癥程度和萎縮損傷程度呈正相關[29]。有研究發現NOX4 通過產生ROS 和激活Gli1信號在胃癌細胞生長和凋亡中起重要作用[12]。NOX1、NOX2 與NOX4 也被認為參與了血管生成的各個階段，在癌癥誘導的血管形成中發揮著關鍵作用[13]。NF-κB是調控基因轉錄的重要因子，p65蛋白是NF-κB中的一種重要轉錄因子，被認為廣泛參與了細胞生長、分化、炎癥、免疫應答等多方面的表達調控，其過度表達與多種慢性炎癥性疾病及腫瘤發病密切相關，磷酸化的p65蛋白（p-P65）是p65 蛋白的活化形式。有報道稱Hp 感染后NF-κB 呈激活狀態，且萎縮性胃炎患者胃黏膜萎縮病變程度與Hp 感染和p-P65 的表達呈正相關[30]，隨著胃黏膜病變程度的加重，胃黏膜中p-P65 表達及Hp 陽性率均增高[31]?；罨疦F-κB 的因素有很多，包含病原體、ROS等，其中NOX是一個關鍵的酶系統，NOX2等過表達會產生過量的ROS 激活NF-κB 信號通路，同時促進STAT 磷酸化。STAT1 已被證明通過調節免疫系統和促進腫瘤免疫監測來發揮抗腫瘤作用，是腫瘤血管發生、生長和轉移的負調節因子，被認為是潛在的腫瘤抑制因子，現多認為其可促進腫瘤細胞凋亡，抑制胃癌細胞增殖及侵襲、遷移能力[32-33]，有研究顯示Hp 感染后明顯抑制STAT1 核易位[34]；且胃癌患者血清STAT1 表達水平顯著低于慢性胃炎組和健康對照組[35]。

如今人們居住條件和生活水平大大提高，過食肥甘厚味，腦力勞動偏多，脾氣不健，加之作息不規律，濕熱內蘊常見。作為慢性萎縮性胃炎的重要致病因素，Hp 也被認為是一種濕熱性質的伏邪，正氣不甚虛時，其隱匿于胃部伏而不發，長期感染造成胃黏膜的持續炎癥，加重黏膜病理改變[36]。

濕邪日久傷陽，熱邪日久耗陰，濕熱膠結難化，纏綿體內導致陰陽俱損，中氣更虛，氣血不榮則黏膜萎縮、納運失司，濕熱不去而釀毒損絡成瘀，胃黏膜病變漸生，瘀血與濕濁、濕熱蘊結，久化瘀毒，裹挾留滯[37]，瘀血證的出現常被認為是黏膜惡變的重要標志。

Hp+CAG 組患者胃黏膜NOX1 mRNA、NOX2 mRNA、NOX4 mRNA、NF-κB mRNA 與p-P65 水平顯著增高，STAT1 表達水平降低。說明Hp 感染后NOX/NF-κB 信號通路異常激活，促進組織損傷與促炎因子的釋放，使萎縮性胃炎患者胃黏膜炎癥程度和活動度增加，而STAT1 水平顯著降低，“炎癌轉化”風險增加。此外，Hp 感染使CAG 患者胃黏膜Gli1 mRNA、Shh mRNA、Smo mRNA、Ptch mRNA 水平顯著降低，同時Gli2 mRNA 與Gli3 mRNA水平顯著增高，說明Hp感染后CAG 患者胃黏膜Hh-Ptch-Smo-Gli 信號通路可能受抑制。有研究表明Hp 感染后可能通過下調胃黏膜Shh 蛋白的表達導致胃黏膜萎縮及腸上皮化生（IM）[38]。Shh在CAG 腸化生組織中表達率低于在非萎縮性胃炎胃組織中的表達率[39-40]，也提示Shh分泌不足與胃黏膜腸上皮化生有關。

在CAG“炎癌轉化”過程中，不可忽視的環節是源自骨髓的間充質干細胞（MSCs）被招募到組織損傷部位。Donnelly 等[41]發現MSCs 在Hp 感染的小鼠胃發育不良腺體中增殖，出現腸化生和異型增生。當募集的MSCs 重新填充胃上皮時，炎癥細胞因子持續存在而缺乏足夠的Shh，導致胃上皮異常再生，出現異型增生和癌癥[42]。Hp感染誘導的慢性炎癥環境與Shh分泌不足或傳導抑制是在CAG 發生發展過程中的兩個關鍵因素。胃黏膜存在長期慢性炎癥的情況下，Shh 信號通路的失調會進一步導致胃上皮分化異常和胃癌。不少研究證實，益氣活血法可激活hedgehog 信號通路，對萎縮性胃炎癌前病變大鼠胃黏膜病變起到改善作用[43-44]。

總結而言，存在Hp 感染的萎縮性胃炎患者胃黏膜病變機率高，可能與胃黏膜長期炎癥，以及Hp 感染下調Shh、Gli1、Smo mRNA 表達水平，上調Gli3 表達水平，抑制Hh-Ptch-Smo-Gli 信號通路，同時使NOX/NF-κB/STAT1信號通路異?；罨嘘P。