白術治療潰瘍性結腸炎作用機制的網絡藥理學分析及實驗驗證研究＊

余學成，高增祥，吳 斌，涂濟源，2，陳林霖，曹國勝，2＊＊

（1.湖北中醫藥大學藥學院 武漢 430065；2.湖北省中藥炮制工程技術研究中心 武漢 430065）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種常見的、慢性的、非特異性的炎癥性疾病，任何年齡均可發病，多見于年輕群體，其病因尚不明確，在臨床上，常表現為血性腹瀉、便血等癥狀[1-3]。其發病機制復雜，遺傳、免疫失調、腸道菌群失調、環境等是目前普遍認為的誘發因素[4]。近年來，全球的UC 發病率一直在上升[5]。目前臨床上有氨基水楊酸類、皮質固醇類和免疫調節劑類等作為治療UC 的常用藥物，但其副作用明顯且易復發[6-7]。近年來，隨著中醫藥在治療UC 方面取得了巨大的進展，從傳統中醫藥理論出發，尋找安全有效的治療UC的藥物顯得十分迫切。

根據UC 臨床表現，在我國傳統醫學理論中，把UC歸屬于“泄瀉”、“腸風”以及“痢疾”等范疇，認為UC的發生是由脾失健運、濕熱蘊腸所致[8]，故圍繞健脾益氣、祛濕止瀉為治療UC 的基本法則。而白術具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功效[9]，現代研究也表明白術具有免疫調節、抗炎、抗腫瘤等作用，對不明原因的腸炎也具有較好的療效[10]。臨床上通過常規治療手段聯合應用白術治療效果顯著，其可明顯改善患者的臨床癥狀[11-12]。白術的主要活性成分之一白術多糖（Atractylodes Macrocephala Polysaccharides，AMP）可以改善潰瘍性結腸炎，其治療效果與調節腸道菌群組成、糞便代謝和血漿代謝的能力有關[13]。另一主要活性成分之一白術內酯III 可通過維持線粒體功能來減弱UC發展進程中的上皮屏障的破壞[14]。因此，推測白術對UC 具有較好的改善作用，但其治療UC 的潛在分子機制尚未完全清楚，有待進一步研究。

網絡藥理學是多交叉學科，以系統層次和生物網絡的整體角度為出發點闡釋藥物作用、疾病機制的新興學科，其通過探索疾病與藥物之間的分子關聯，從而揭示藥物作用于人體多靶點，多層次的機理[15-17]?；诰W絡藥理學角度，從中藥多成分、多靶點、多環節的作用特點出發，為系統闡明中藥治療UC 等復雜疾病的分子機制提供了研究策略[18]。本研究擬基于網絡藥理學、分子對接技術及體內實驗驗證系統性分析白術治療UC 的作用機制，為臨床應用白術等健脾燥濕中藥治療UC疾病提供實驗依據和思路借鑒。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 網絡藥理學數據庫的整理

將本文所使用的數據庫及軟件進行了相關整理，見表1。

1.1.2 白術活性成分的篩選

通過TCMSP數據庫、TCM-ID數據庫的檢索，以及查閱相關文獻[19-20]，去重后以口服生物利用度（Oral bioavail-ability，OB≥30%）和類藥性（Drug likeness，DL≥0.05）為條件[21]獲取并篩選白術的有效活性成分信息。

1.1.3 藥物活性成分的靶點篩選

應用Swiss 數據庫進行藥物活性成分的靶點篩選，選取Probability>0 的靶點。有部分活性成分靶點在Swiss 數據庫中未找到，將其靶點通過Batman-TCM數據庫進行補充。

1.1.4 疾病靶點的收集、共同靶點的獲取以及網絡圖的構建

以“ulcerative colitis”為關鍵詞在GeneCards 數據庫中搜索，收集UC 疾病的相關靶點。將疾病與藥物靶點取交集，并利用Venny2.1.0 進行交集分析并構建韋恩圖。將通過上述步驟得到的相關靶點、藥物、活性成分、疾病進行整理后導入到Cytoscape 中構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。

1.1.5 PPI網絡的構建

將上述疾病與藥物的共同靶點導入到String 數據庫中，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，其他均為默認條件，得到PPI 網絡并導入到Cytoscape 3.7.2 軟件中，通過軟件插件Centiscape 2.2 進行核心靶點的篩選。以插件中的Degree、Closeness、Betweenness 三個參數進行核心靶點篩選，選取大于三個參數值的靶點，進行篩選2次，最終得到核心靶點。將核心靶點導入到String 數據庫中，默認條件，再將得到的網絡圖導入Cytoscape 3.7.2軟件中，得到最終的核心靶點PPI網絡圖。

1.1.6 GO功能富集分析和KEGG信號通路注釋分析

將1.1.5中最終篩選得到的核心靶點導入到David數據庫中，相關參數設置如下：物種選擇為“Homo sapiens”，列表類型設置為“gene list”，標識符選擇“official gene symbol”，之后進行GO 功能富集分析與KEGG 信號通路注釋分析，前者選擇P值排名前10 的進行氣泡圖的繪制，后者選取P 值排名前20 的進行氣泡圖的繪制。

1.1.7 通路靶點網絡圖的構建

將KEGG 信號通路注釋分析結果中的基因、通路數據以及活性成分進行整理，導入到Cytoscape 3.7.2軟件中進行，構建“通路-活性成分-靶點”網絡圖。

1.1.8 活性成分與靶點蛋白的分子對接

應用分子對接軟件Autodock 進行分子對接，在UniProt數據庫中獲取相關靶點的“Entry”，再以獲取的具體“Entry”為關鍵詞在PDB 蛋白數據庫中檢索從其中選取相關蛋白并下載其Pdb 結構，將其導入到Pymol2.5 軟件中刪除所有水分子和多余的小分子配體。在Pubchem 數據庫中獲取活性成分的3D 結構文件，并應用Open Babel GUI 軟件將其轉為mol2 格式。將處理好的蛋白與活性成分導入Autodock Tool 1.5.7軟件轉換為pdbqt 格式，之后使用Autodock Vina 1.1.2軟件進行兩兩分子對接，并計算出結合能（kcal/mol）。最后，利用Pymol2.5軟件進行可視化。

1.2 驗證性實驗

1.2.1 實驗試劑及藥物

無水乙醇（批號20180904），購自國藥集團化學試劑有限公司；柳氮磺吡啶腸溶片（SASP）（批號09220718），購買自上海信誼天平藥業有限公司；人尿素糞便隱血試劑盒（批號20221104），購自南京建成科技有限公司；通用型組織固定液（批號G1101），購自武漢賽維爾生物科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS，批號160110），購自美國MP Biomedicals 公司；IL-1β（博奧森，bs-0812r），濃度為1/200；TNF-α（三鷹，60291-1-ig），濃度為1/200；白術（生產批號20220101），產地浙江，購自湖北天濟藥業有限公司，由湖北中醫藥大學藥學院余坤教授鑒定為菊科植物白術Atractylodes macrocephala koidz.的根莖。

1.2.2 動物

SPF級BALB/c 小鼠32只，雄性，體質量20±2 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2022-0001。小鼠在清潔環境中進行飼養，不限制飲水和進食，飼養環境溫度為22±2℃，濕度為55%±5%，光照環境和黑暗環境各交替循環12 h，小鼠適應性喂養3天后進行后續實驗。

1.2.3 儀器

電子天平（CPA225D），購自美國梅特勒-托利儀器有限公司。旋轉蒸發儀（RE-52AA），購自上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機（LGJ-12N），上海華璽科學儀器有限公司；粉碎機（DFY-800C），購自溫嶺市大機械有限公司；其他的小型儀器，如燒杯、鑷子、剪刀等。

1.2.4 實驗藥物制備

（1）DSS 溶液的制備：將稱量的3.5 g DSS 試劑溶解與純水中，配制成3.5%的DSS溶液。

（2）白術醇提物的制備：稱取25 g 白術，打粉機將進行粉碎，所得粉末過2號篩，從中取20 g白術粉末置于燒杯中，加十倍量80%乙醇浸泡過夜。次日將其超聲提取3 次（每次操作均相同），每次30 min，后將3 次所得濾液合并，并將其旋蒸（50℃，40 r·min-1）至濃膏狀。將所得樣品在-80℃條件下過夜，次日冷凍干燥，后置于-20℃條件下保存備用。

（3）柳氮磺吡啶腸溶片（SASP）混懸液制備：在研缽中將SASP 片劑研磨至極細粉末后配制成濃度為250 mg·10 mL-1的混懸液。將其分裝，4℃冷藏備用。

1.2.5 動物分組、造模以及給藥

將32 只老鼠隨機分為4 組，分別是空白組（Control）、模型組（Model）、白術組（BZ）和陽性藥組（SASP），每組各8 只，適應性喂養3 天，第1 天起，小鼠自由飲用3.5% DSS溶液，每2天更換新制的DSS溶液。第2 天起，各組分別給藥，空白組，模型組均灌胃生理鹽水，白術組組灌胃白術醇提物，參考《中國藥典》規定：白術用量6-12 g。此實驗按成人白術9 g·60 kg-1給藥，考慮小鼠與人劑換算系數12.3，則白術劑量為1845 mg·kg-1·d-1。陽性藥組灌胃柳氮磺吡啶（SASP），劑量為250 mg·kg-1·d-1。各組按1 mL·100 g-1給藥，連續給藥7天[22]。

1.2.6 檢測各組小鼠DAI評分和結腸長度變化

自實驗開始第1天起，每天在相同時間段內，對小鼠進行稱量并記錄鼠體質量，觀察小鼠大便形狀及便血情況并進行記錄，小鼠大便隱血情況按照隱血試劑盒說明書的方法進行測定，參考相關文獻并計算DAI評分，DAI評分標準如表2所示，計算公式為：DAI評分=體質量變化評分+大便性狀評分+隱血或便血評分。末次給藥后處死小鼠，取出小鼠結腸并用直尺測量其自然長度，記錄并拍照。

表2 DAI評分表

1.2.7 HE染色觀察各組小鼠結腸組織病理學變化

取小鼠結腸組織，多聚甲醛進行固定，脫水，石蠟包埋，切片，置于載玻片上，進行HE 染色。光學顯微鏡下對結腸組織結構、杯狀細胞、絨毛排列及炎性細胞浸潤等組織病理學變化情況進行觀察并拍照。HE染色病理學評分標準：①炎性損傷程度：無炎性反應，0分；輕度炎性反應，1分；重度炎性反應，2分。②病變損傷深度：無病變，0分；病變侵及黏膜下層，1分；病變侵及肌層，2分；病變侵及漿膜層，3分。③隱窩損傷程度：無損傷，0分；基底1/3隱窩被破壞，1分；基底2/3隱窩被破壞，3分；全部隱窩和上皮被破壞，4分。計算公式：病理學評分=炎性反應+病變深度+隱窩損傷。

1.2.8 AB-PAS 染色觀察各組小鼠結腸組織中杯狀細胞數目

取小鼠結腸組織石蠟塊，切片，置于載玻片上，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，先后用阿利新藍染色液染色、過碘酸溶液浸泡，并加入Schiff 試劑反應，再經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后封片。光學顯微鏡下進行鏡檢，呈現藍色的為酸性黏液質，呈現紅色的為糖原和中性黏液質。

1.2.9 免疫組織化學法檢測各組小鼠結腸組織中IL-1β、TNF-α蛋白表達的變化

免疫組織化學法如下：取各組小鼠結腸組織石蠟塊，切片，置于載玻片上，脫蠟后進行抗原修復，4℃條件下孵育一抗和二抗，細胞核用蘇木素復染，經梯度乙醇脫水后，封片。光學顯微鏡下鏡檢，其中細胞核呈藍色，相應炎癥因子的陽性表達呈棕黃色。

1.2.10 統計學處理方法

應用GraphPad Prism 8.0 統計軟件對本次數據的結果進行統計分析，計量資料用均值±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩組組間比較采用t檢驗進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 活性成分篩選結果

通過數據庫及文獻查閱篩選，其中有20個活性成分通過TCMSP 數據庫篩選得到，16 個由TCM-ID 數據庫及查閱文獻得到，經去重后共得到30 個活性成分（見表3）。

表3 活性成分信息表

2.2 白術治療UC的潛在靶點預測以及網絡圖的構建

將篩選出白術活性成分的“Canonical SMILES”結構導入到Swiss Target Prediction數據庫中，設置條件為Probability>0，未在該數據庫中找到靶點的活性成分用Batman-TCM 數據庫進行補充，得到相應靶點591 個。再以“ulcerative colitis”為關鍵詞應用GeneCards 數據庫進行疾病靶點的檢索，得到靶點5139個。

將白術的預測作用靶點及潰瘍性結腸炎疾病的靶點導入Venny2.1.0，取兩者交集，得白術和潰瘍性結腸炎共同靶點308 個，藍色部分為白術活性成分相關靶點，黃色部分為UC相關靶點，見圖1A。

圖1 白術治療UC的潛在靶點預測以及網絡圖PPI的構建

將所得靶點、信息進行整理，導入Cytoscape3.7.2軟件，繪制“藥物-疾病-成分-靶點”網絡圖，結果見圖1B。其有338 個節點，1206 條邊。圖中深紅色節點（菱形）為白術和疾??；淺紅色（倒三角形）為活性成分；淺黃色（圓形）為靶點。

將白術和潰瘍性結腸炎共同交集的308個靶點基因導入String 數據庫，獲取得到相應的文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制靶點蛋白相互作用的網絡圖，共得308 個節點，4950 條邊。因其節點過多，故運用Cytoscape 3.7.2 軟件插件Centiscape 2.2 進行核心靶點的篩選。將篩選得到的22 個核心靶點再次導入STRING 數據庫，下載其Tsv 文件，將文件導入Cytoscape 3.7.2 軟件，得到核心靶點的PPI 網絡圖，其有22 個節點，227 條邊。根據度值的大小來設定節點的大小以及顏色，顏色越深、大小越大，度值越大。結果所示IL-1B、TNF、AKT1、MAPK3 等為排名靠前的靶點，結果見圖1C。圖中外圈顏色較深，說明靶點度值較大，內圈為黃色和藍色，顏色較淺，說明靶點度值較小，其中藍色靶點的度值最低。

2.3 GO功能富集和KEGG通路富集分析

運用DAVID 數據庫對白術作用于UC 疾病中的22 個核心靶點進行生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細胞組分（Cellular component，CC）等分析。通過GO 分析得到322 條BP 程條目，38 條MF 條目，33 條CC 條目。分別根據P值進行排序，對各富集結果排名前10 的條目進行可視化，見圖2。

圖2 GO功能富集分析

再通過DAVID 數據庫對22 個核心靶點進行KEGG通路富集分析得到145條通路，根據P值進行排序，顯著性最大的前20 條通路見圖3。除去不相關的廣譜通路，可知白術治療UC 的主要信號通路涉及表皮生長因子受體信號通路（EGFR）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

圖3 KEGG通路富集分析

2.4 白術“藥物成分-靶點-通路”網絡的構建及分析

將白術活性成分、排名前20的通路及富集其上的靶點進行整理，將整理好的文件導入到Cytoscape 3.7.2軟件中進行網絡圖的構建，結果見圖4，其有68 個節點，290 條邊。圖中綠色（倒三角形）代表白術防治潰瘍性結腸炎的相關通路，橙色（三角形）代表白術的活性成分，粉紅色（圓形）代表白術防治潰瘍性結腸炎作用靶點。兩者間的對應關系由各節點之間的連線代表。其表明白術可能通過多成分，多靶點，多信號通路來起到防治潰瘍性結腸炎的作用（見表3）。

圖4 藥物活性成分-對應靶點-信號通路網絡圖

2.5 分子對接驗證

白術內酯I、II、III 雖然在上述活性成分排名中較為靠后，但白術內酯類成分作為白術的主要活性成分，有大量文章報道其具有很好的抗炎活性[23-24]，故將這3種活性成分也納入核心成分進行分子對接?；诖?，選擇BZ10、BZ11、BZ12、BZ15、BZ16、BZ17 共6 個活性成分和排名靠前的白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）兩個靶點進行兩兩分子對接驗證。結合能越小代表結合構象越穩定，結合能小于-5 kcal·mol-1表示具有結合能力，結合能小于-7 kcal·mol-1表示結合能力較強[25]。白術6 個活性成分與IL-1β、TNF-α 的分子對接示意圖，如圖5 所示。分子對接結果顯示白術6 個活性成分與IL-1β、TNF-α 兩個靶點均具有較好的結合能力（均小于-5.0 kcal·mol-1），提示白術改善UC 可能有抑制相關炎癥因子的釋放有關，但需要進行實驗驗證。

圖5 關鍵活性成分與靶點的對接及結合能模式圖

2.6 體內實驗驗證結果

2.6.1 白術對各組小鼠結腸長度、小鼠DAI 評分的影響

在對動物進行取材的過程中發現模型組小鼠腸道與其他組小鼠腸道相比出血較明顯，有明顯的潰瘍癥狀，腸道內糞便呈稀樣，異味明顯，腸道彈性較差，白術組（BZ）和SASP 組的小鼠腸道的狀況則有明顯改善，空白組腸道狀況正常。由圖6A、6B 所示空白組與模型組相比較，模型組結腸長度明顯減少（P<0.01）；和模型組相比，白術組（BZ）和SASP 組小鼠的結腸長度均有所增加（P<0.01）。由圖6C 所示空白組和模型組相比，模型組DAI評分顯著增加（P<0.01），可知實驗造模成功，和模型組相比較，白術組（BZ）與陽性藥組的DAI評分均有所降低（P<0.01）。

圖6 白術對各組小鼠結腸長度、小鼠DAI評分的影響

2.6.2 白術對各組小鼠結腸組織病理學變化及杯狀細胞數目的影響

如圖7A 所示，細胞核呈藍紫色，細胞質呈粉紅色。HE 染色結果顯示，和空白組（Control）相比，模型組（Model）結腸組織結構破壞嚴重，炎性浸潤明顯，黏膜水腫明顯，上皮細胞損傷嚴重。和模型組相比，白術組（BZ）和SASP 組的結腸組織病理狀態改善明顯，粘膜上皮細胞排列較為緊密，炎性浸潤減輕。圖7B為病理學評分的統計圖，統計結果與HE 染色結果的趨勢一致。

圖7 白術對各組小鼠結腸組織病理形態學變化及杯狀細胞數目的影響

如圖7C所示，糖元、中性粘液物質呈紅色，酸性粘液呈藍色。AB-PAS 染色結果顯示，和空白組相比，模型組結腸組織中杯狀細胞個數明顯減少，和模型組相比較，白術組（BZ）、SASP 組的顏色有所加深，染色陽性細胞有所增加。結果表明白術給藥治療后可明顯增加UC小鼠結腸組織中杯狀細胞的個數。

2.6.3 白術對各組小鼠結腸組織中關鍵靶點IL-1β、TNF-α表達的影響

由圖8 所示，棕褐色代表陽性，藍色代表細胞核。免疫組化檢測結果顯示，相比較于空白組，模型組小鼠結腸組織中炎性因子IL-1β 及TNF-α 陽性表達有所增加；而相比較于模型組，白術組（BZ）、陽性藥柳氮磺吡啶（SASP）組小鼠結腸組織中IL-1β 及TNF-α 陽性表達有所減少，且IL-1β 陽性表達減少更為明顯。研究結果表明，白術可通過抑制UC 小鼠結腸組織中IL-1β、TNF-α 等炎癥因子的表達減緩炎癥反應的發生來改善UC損傷。

圖8 白術對各組小鼠結腸組織中關鍵靶點IL-1β、TNF-α表達的影響（IHC，×100）

3 討論

UC 易復發，且發病率逐年上升，給醫藥衛生行業帶來了巨大挑戰[26]。因其嚴重影響患者的生活質量，世界衛生組織將其確定為現代難治性疾病之一[27]。傳統中醫學認為濕熱內蘊是UC 的主要發病機制，多與脾氣受損、濕滯日久等因素有關[28]，而白術歸脾、胃二經，具有健脾燥濕的功效，自古以來白術就被歷代醫者用于治療脾胃相關疾病[29]。

本研究運用網絡藥理學方法篩選出白術19 個有效活性成分，443個作用靶點以及225個藥物與疾病交集靶點。研究表明，白術內酯類成分、揮發油及白術多糖等是白術的主要活性成分，并被證實有廣泛的藥理作用[30-31]。其中，白術內酯I、II 均有良好的抗炎、抗氧化作用[32-33]。此外，白術內酯III 可通過調節自噬水平清除過氧化物減輕小鼠UC 損傷[34]。白術揮發油對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸道沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長均有抑制作用[35]。另外，白術多糖還可減輕機體炎癥反應，改善類風濕性關節炎，其機制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路的活化有關[36]。大量研究表明，出自《太平惠民和劑局方》的參苓白術散被常用于治療脾胃氣虛、濕阻氣滯證，針對UC 疾病具有良好的療效[37-38]，因此，推測白術對潰瘍性結腸炎的治療有很好的效果。體內動物實驗結果表明，白術醇提物組可明顯增加UC 小鼠的結腸長度，降低DAI 評分，還可以改善UC 小鼠結腸組織病變程度，增加小鼠結腸組織中杯狀細胞的個數，這均提示白術對UC小鼠具有較好的療效。

白術作用靶點間的協調促進和抑制可能會增加結腸上皮細胞的癌癥風險，并加速轉化為調節復雜疾病表型的新型功能模塊或協同模塊組合[39]。本研究篩選出的核心靶點主要有IL-1B、TNF、MAPK3、AKT1 等。研究表明，在UC的炎癥反應過程中，TNF-α是促使UC發生與發展的炎癥啟動因子，其是導致腸黏膜損害以及微循環障礙的重要因素[40]。TNF-α炎癥因子主要通過對中性粒細胞趨化作用，對腸黏膜組織細胞進行浸潤，從而導致炎癥損傷[41]。炎癥因子IL-1β可增強炎癥損傷，使UC 病情加重[42]。因此，選擇TNF-α 及IL-1β 兩個關鍵靶點進行了體內驗證實驗。實驗結果發現白術可使UC小鼠結腸組織中TNF-α、IL-1β表達情況下降，從而減輕機體炎癥反應發揮對UC的改善作用。

綜上，白術可通過減少TNF-α、IL-1β在結腸組織中的表達量來抑制UC 小鼠的炎癥反應，從而改善UC的癥狀。本研究基于網絡藥理學和分子對接技術角度，并進行了體內動物實驗進行初步驗證。此外，本研究存在一定的局限性，比如實驗驗證的方法較為單一，未對預測得到的其他信號通路展開實驗驗證，但在某種程度上為臨床應用健脾燥濕等中藥治療UC 提供了實驗依據與思路借鑒[43]。