板藍根配方顆粒噴霧干燥工藝優化研究＊

張蘭蘭，施文婷，陳偉媚，楊 贊，黃醒鵬，田清清，張 正

（廣東一方制藥有限公司廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室 佛山 528244）

板藍根藥用部位為干燥根，取自十字花科植物菘藍（拉丁名為Isatis indigoticaFort.），具苦寒之性，有清熱解毒、涼血利咽的功效，可用于瘟疫時毒、發熱咽痛等病癥[1]?，F代藥理學研究發現，板藍根具有豐富的藥理作用，包括抗菌、抗病毒、抗內毒素和增強機體免疫調節等[2]，具有重要的臨床價值。板藍根主要化學成分有核苷類、木脂素類和生物堿類[3-4]，其中生物堿類是其抗病毒作用的關鍵成分，核苷類可干擾病毒核酸的合成達到抗病毒效果[5-6]。板藍根配方顆粒是由板藍根飲片經現代工藝加工而成，陳諾[7]利用薄層色譜法和高效液相色譜法驗證了板藍根配方顆粒及其飲片在化學成分上的一致性及等效性，早年亦有學者研究了不同干燥方式對板藍根水提物有效成分的影響，證明了噴霧干燥的優勢[8-10]，但尚未出現有關板藍根配方顆粒噴霧干燥工藝的系統研究報道。

中藥制劑工藝包括提取、分離純化、干燥、制劑成型等環節，各工藝單元對中間體及制劑成品的質量均會產生不同程度的影響。因此，本文基于質量源于設計（Quality by design，QbD）理念對板藍根配方顆粒成型過程中的噴霧干燥工藝進行研究，結合信息熵賦值法，以得粉率、尿苷含量、腺苷含量、鳥苷含量和(R,S)-告依春含量的綜合評分作為評價指標[11]，通過Plackett-Burman 試驗設計（PBD）篩選關鍵工藝參數，再通過中心點復合設計（Center Point Composite design，CCD）優化關鍵工藝參數，建立板藍根配方顆粒噴霧干燥工藝的數學模型和設計空間，最后進行工藝驗證[12]，以期為板藍根配方顆粒的生產過程質量控制提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

本研究所用儀器詳見表1。

表1 研究所用儀器

1.2 試藥

本研究所用試藥詳見表2，其中板藍根藥材經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定正品，同時經質量部門檢驗合格，可供本研究使用。

表2 研究所用試藥

2 方法與結果

2.1 板藍根清膏的制備

按照2020 版《中國藥典》一部板藍根項下飲片炮制方法[1]，將板藍根藥材制成板藍根飲片，再依據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》的相關規定[13]，確定板藍根浸膏的制備方法為：取板藍根飲片1.6 kg，第1 次加飲片量8 倍水，加熱煎煮30 min，第2 次加飲片量6 倍水，加熱煎煮30 min，提取液均趁熱用350 目篩網濾過，減壓濃縮（70℃，-0.1 MPa）至相對密度為1.12（70℃）的清膏樣品，保存備用。

2.2 噴干粉得粉率計算

每組試驗取板藍根清膏適量，控制每組試驗所用清膏含固量約為30 g，置于磁力攪拌器上，按各試驗組要求調節所需工藝參數進行噴霧干燥，噴霧干燥結束后，在相對濕度為40%以下的環境中收集噴干粉，計算每組試驗得粉率，計算公式為：噴干粉得粉率（%）=噴干粉量/清膏含固量×100[11]。

2.3 四種成分含量測定方法

2.3.1 色譜條件

采用Agilent TC(2) C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇、0.1%磷酸溶液構成的雙相溶劑系統按表3 所示進行梯度洗脫[14]；每分流速為0.8 mL；色譜柱溫度為30℃；檢測波長為245 nm；進樣量為10 μL。

表3 梯度洗脫表

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春對照品適量，加水制成質量濃度分別為79.6204、63.1798、68.8744、142.9000 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取板藍根噴干粉1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入50 mL 水，密塞，稱定重量，設定數控超聲波清洗器的功率為600 W、頻率為40 kHz，進行20 min的超聲處理，取出，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗

分別精密吸取空白溶劑、混合對照品溶液及供試品溶液，依法測定，記錄色譜圖[15]，如圖1 所示，在相應的保留時間處，供試品溶液與混合對照品溶液色譜均被洗脫出相同的色譜峰，空白溶劑對應保留時間處無色譜峰出現，表明色譜條件具有良好的專屬性。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖

2.4.2 線性關系考察

分別精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液，加甲醇稀釋制成系列濃度的混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖[11,16]。以對照品質量濃度（μg?mL-1）為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，進行線性回歸，得到各待測組分的回歸方程及線性范圍見表4。結果表明各成分在相應的濃度范圍內與峰面積的線性關系良好。

表4 線性關系考察結果

2.4.3 精密度試驗

精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續進樣6 次[17]，計算尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春色譜峰峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗

取同一份板藍根噴干粉，按“2.3.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定[11]。計算尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春含量的RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗

精密吸取“2.3.3”項下同一份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進樣測定[11]，計算尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春色譜峰峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗

取已知含量的板藍根噴干粉適量，精密稱取9份，每份約0.5 g，置具塞錐形瓶中，分為3 組，每組分別按高、中、低濃度精密加入混合對照品溶液。按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積[18]，計算加樣回收率及RSD，見表5。結果表明尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春的平均加樣回收率分別為99.96%、99.61%、97.42%、98.20%，RSD 分別為1.74%、2.75%、2.18%、1.24%。表明該方法準確度良好。

TCP協議的通信過程為：服務器端必須首先通過指定IP地址以及端口名建立偵聽，等待客戶端響應連接；然后客戶端向對應的服務器所設定的IP地址和端口發出連接請求；待服務器與客戶端成功建立連接后，雙方方可通過讀寫函數控件收發數據，完成數據傳輸時，需先從客戶端斷開連接后服務器才能斷開連接。

表5 加樣回收率試驗結果（n = 9）

2.5 數據處理

熵值法是一種基于差異驅動的客觀賦權法，即根據各個指標在總體中的變異程度賦予權重[19]。指標變異程度越大，則信息熵越小，能提供的有效信息就越多，其賦予的權重也就越大[20]。

①數據無量綱處理：由于不同指標之間數量級不同，需要對數據進行標準化處理。本文根據公式：無量綱化值（Yij）＝（實測值－最小值）/（最大值－最小值）對原始數據進行處理，即

式（1）中Xij表示第i次試驗中j項指標所得試驗值。

②消零處理：原始數據無量綱化處理后數據的最小值為0，為了使數據有意義，本文對Yij的最小值0 取0.001。

③數據歸一化處理：根據公式對數據進行歸一化處理，即計算第i次試驗在j項指標下的概率，計算公式：

式（2）中n表示試驗組數。

④各指標信息熵計算：根據公式：

⑥各指標熵權系數計算：根據公式：

式（5）中Wj表示第j項指標的權重值，m 表示試驗指標個數。

2.6 板藍根噴霧干燥工藝優化

2.6.1 確定關鍵工藝參數（CPPs）和關鍵質量屬性（CQAs）

中藥噴霧干燥過程的影響因素主要包括：工藝參數、藥液、環境、設備[21-22]，見圖2。根據生產經驗及文獻查閱[22-24]，初步選取藥液相對密度、藥液溫度、進液速度、進風溫度和霧化壓力作為影響板藍根噴霧干燥工藝的CPPs。2020 年版《中國藥典》一部板藍根項下對(R,S)-告依春成分進行定量控制[1]，國家藥典委員會頒布的《關于中藥配方顆粒國家藥品標準（第一批）的公示》項下“008.板藍根配方顆粒（編號：YBZ-PFKL-2021008）”同樣對(R,S)-告依春進行定量控制，同時標準中的特征圖譜中以尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春作為特征峰[14]。研究表明，核苷類成分是板藍根抗病毒作用的主要活性成分[25]，選取以上4 個成分進行含量測定對板藍根配方顆粒質量控制具重要意義。板藍根噴干粉的得粉率直接影響生產產量，因此將得粉率和尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春的含量作為板藍根噴霧干燥工藝的CQAs。

圖2 板藍根配方顆粒噴霧干燥工藝參數篩選魚骨圖

2.6.2 PBD試驗篩選CPPs

Plackett-Burman 試驗設計可通過較少的試驗從眾多影響因素中快速、準確、高效地篩選出顯著因素[26]。以藥液相對密度（A）、藥液溫度（B）、進液速度（C）、進風溫度（D）、霧化壓力（E）為自變量，以得粉率（Y1）和尿苷（Y2）、腺苷（Y3）、鳥苷（Y4）、（R,S）-告依春（Y5）的含量作為CQAs，采用Minitab 16.0 軟件設計試驗，試驗由五因素兩水平組成，共12 組試驗。試驗設計及結果見表6、表7。

表6 PBD試驗設計因素水平表

表7 PBD試驗結果

對PBD 試驗結果進行方差分析，結果見表8，可知藥液相對密度（A）和進液速度（C）對OD值的影響顯著（P<0.05），其它三個因素對OD 值無顯著影響，故下一步選擇藥液相對密度和進液速度作為優化試驗的關鍵工藝參數。

表8 PBD試驗的方差分析結果

2.6.3 CCD試驗優化關鍵工藝參數

基于上述PBD 試驗設計結果的基礎上，采用CCD進一步優化板藍根配方顆粒噴霧干燥工藝。以藥液相對密度（A）和進液速度（C）為關鍵考察因素，控制其余3個不顯著影響因素的水平分別為進風溫度175℃，藥液溫度50℃，霧化壓力0.5 Mpa，采用Design Expert 8.0.6軟件設計試驗，試驗設計及結果見表9、表10。

表9 CCD試驗設計因素水平表

表10 CCD試驗結果

采用Design Expert 8.0.6 軟件對表10 中的數據進行處理，以藥液相對密度（A）、進液速度（C）為自變量，Y1-Y5的總評OD 值為因變量，進行多元回歸分析，并進行方差分析和擬合優度分析。由模型擬合結果，發現二次多項式模型擬合方程有顯著意義，回歸方程為OD=-93.09408+165.51492A+0.31313C-0.24187AC-73.58594A2-0.000742375C2，其方差分析見表11，藥液相對密度（A）、進液速度（C）對OD 值影響的三維效應面圖和等高線圖，見圖3。

圖3 藥液相對密度和進液速度對OD值影響的響應面圖與等高線圖

表11 回歸模型的方差分析及擬合優度分析

由表11可知，回歸模型P<0.05，失擬項P>0.05，表明該方程模型顯著性高，擬合度良好，失擬項無統計學意義，未知因素對試驗干擾較小，可用于板藍根配方顆粒噴霧干燥工藝參數優化過程的預測?；貧w模型中A、C、AC、A2、C2的P值均小于0.05，說明均對OD值影響顯著。由圖3 可知，當藥液相對密度一定時，OD 值隨進液速度的增加而增大；當進液速度一定時，OD值隨藥液相對密度的增加而增加。

2.7 設計空間建立

在設定的參數空間內搜索滿足OD 值大于0.65 的所有因素組合，同時設置α=0.05 水平的置信區間，即構成設計空間，結果用Overlay polt 展示，見圖4。圖中亮黃色區域為加入95%置信區間后的設計空間，在此設計空間所有的點都符合工藝目標的期望值，暗黃色區域為原設計空間內不可靠的部分，在此空間的所有點有5%的概率無法滿足工藝目標。因設計空間并不規則，不便對二者進行嚴格控制[12]，為了便于操作，推薦的操作空間范圍藥液相對密度為1.05-1.08，進液速度為30%-40%。

圖4 板藍根配方顆粒噴霧干燥工藝設計空間

2.8 設計空間驗證試驗

在設計空間內隨即選取6個工藝設計參數進行驗證，用來檢驗所建模型的預測能力[27]。1 號、2 號、3 號為95%置信區間內的點（亮黃色區域），4 號、5 號、6 號為原設計空間內，95%置信區間外的點（淺黃色區域）[12]，驗證試驗結果見表12。對表12中OD 值的實測值與預測值進行配對樣本t檢驗，結果P值大于0.05，表明實測值與預測值無顯著差異，可見模型具有良好的預測能力。

表12 驗證試驗結果

3 討論

近年來，質量源于設計（QbD）理念正在推動制藥生產模式的轉變，并獲得了廣泛的關注[28]，QbD 理念在中藥制劑工藝設計的各個方面均有應用，包括飲片炮制、提取、分離純化、干燥、制劑等，旨在提高工藝穩定性和產品質量可控性[25]。QbD 理念的核心是設計空間的建立，設計空間是能保證工藝品質的關鍵物料屬性和工藝參數的范圍組合[29-30]。本文便是基于QbD 理念，在Plackett-Burman 試驗的基礎上，通過CCD 構建了板藍根噴霧干燥過程中CQA 與工藝CPPs 的回歸模型及工藝設計空間，并進行了驗證，驗證結果表明工藝參數在該設計空間內能保證板藍根配方顆粒噴霧干燥過程和產品質量的穩定。