免疫熒光技術在近視相關生物標志物檢測中的應用進展

趙宇輝 畢宏生 孫華躍 李文慧 田慶梅 盧秀珍

1.山東中醫藥大學眼科與視光醫學院，山東濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬眼科醫院 山東省眼病防治研究院山東省中西醫結合眼病防治重點實驗室，山東濟南 250002；3.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東濟南 250014

免疫熒光（immunofluorescence，IF）技術亦稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種技術；它基于抗原、抗體相互反應的原理，將已知的抗原或抗體用熒光基團（熒光素）標記，再將這種已標記的抗原或抗體與細胞或組織內目標抗原或抗體結合，形成熒光復合體被特定波長的光激發，從而被熒光顯微鏡捕捉[1-3]。IF 已被廣泛應用于細菌病毒和寄生蟲的鑒別診斷、部分疾病免疫學機制的研究、器官移植的鑒定、抗原組織定位等方面。近視是屈光不正中最常見的一種疾病，是導致低視力的主要原因，嚴重損害人們的視覺質量。近年來，IF 在近視研究領域中發揮了巨大的作用。本文就近年來IF 在近視相關的生物標志物檢測中的應用進行綜述，以供研究參考。

1 IF 概述

1.1 IF 的組成和基本原理

IF 主要由直接IF、間接IF、多重IF 和補體參與的IF 等組成。直接IF 是指特異性抗體標記熒光素后直接與目標抗原結合，形成抗原-抗體復合物而被鑒定的方法[1]。但該方法抗體均需熒光素標記，其敏感性較低，應用相對有限。間接IF 是指特異性抗體與目標抗原（一抗）結合后，再加入熒光素標記的二抗，結合形成免疫復合物而被鑒定的方法。間接IF 因其有較好的敏感性和特異性，在臨床和實驗研究中應用廣泛[4]。多重IF 則需進行多重熒光染色，此法可同時檢測多種生物標志物[5]。補體參與的IF 是指利用補體反應，形成了抗原-抗體-補體熒光復合物，熒光顯微鏡下所見到的發出熒光的部分即是抗原所在的部位。

1.2 IF 的發展歷程

IF 的雛形，最早可追溯到1897 年，俄國科學家Metchnikoff 用毒素作為示蹤劑，研究破傷風毒素在雞組織中的定位[6]。人們開始嘗試追蹤可溶性抗原和抗體在動物體內的分布。1941 年Coons 等[7]首次在肺組織中使用熒光素標記了抗肺炎球菌抗體，這代表著IF的誕生。20 世紀60—90 年代，IF 被風濕科、眼科、骨科等學科引入并廣泛應用。近年來，隨著其他領域科技的快速發展，IF 與探針化學、電子計算機和激光共聚焦顯微鏡等結合，使IF 更加靈敏；時間分辨熒光免疫分析法和熒光偏振免疫分析法等IF 分析方法的出現，使得IF 的定量檢測更加準確[8]。IF 已成為醫學基礎研究和疾病診斷的重要手段。

2 IF 在近視相關生物標志物檢測中的應用

2.1 直接IF 在近視相關生物標志物檢測中的應用

一項研究對形覺剝奪性近視（form-deprivation myopia，FDM）大鼠予以0.010%和0.025%的阿托品滴眼治療，并應用直接IF 檢測其視網膜和鞏膜中缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白的表達[9]。實驗選用HIF-1α 熒光抗體為染色抗體進行檢測，發現2 個劑量組HIF-1α 蛋白表達量均有降低趨勢，低濃度阿托品可能通過減少視網膜和鞏膜上HIF-1α 等基因及蛋白表達量來降低鞏膜延展性，延緩近視進展。此外，有研究采用直接IF 對視網膜靜脈阻塞小鼠視網膜缺氧區域進行可視化，腹腔注射缺氧探針哌莫硝唑，凝集素熒光抗體等抗體對視網膜靜脈缺氧細胞進行染色[10]。前述研究表明，直接IF 是探究眼部缺氧的有效手段，為近視缺氧的研究提供了新思路。

在該裝置的內部，包含一個蓄電池、抽氣泵、氣體傳感器、氣體凹槽通道、信息處理系統等，因為SF6氣體的密度大約是空氣的五倍，因此空氣經過長凹槽時SF6會通過長凹槽下沉到隔離板下方，隔離板下方的氣體傳感器會檢測GIS設備內的氣體的濃度通過控制面板將其顯示在顯示屏上。其內部結構如圖一(b)所示。

2.2 間接IF 在近視相關生物標志物檢測中的應用

間接IF 因其特異性較好受到許多研究者們的青睞。一項研究對正常小鼠眼組織進行了間接IF 檢測，腫瘤壞死因子受體超家族成員TNFRSF21 的抗體作為一抗，和綴合熒光染料的二抗一起孵育[11]。結果顯示TNFRSF21 在小鼠眼中強烈表達，對高度近視具有致病性。Tian 等[12]將抗視紫紅質抗體作為一抗來檢測Glra2 基因敲除小鼠視網膜和質粒轉染過表達的原代視網膜細胞中視紫紅質的水平，Glra2 被鑒定為高度近視新的致病基因。另有研究應用間接IF 驗證PPEF2 基因在FDM 小鼠視網膜、293T 細胞和ARPE-19 細胞的表達情況和其與高度近視表型的關系[13]。該研究使用PPEF2 抗體、山羊抗小鼠IgG 孵育，結果明確了PPEF2 在小鼠視網膜的位置，并證明了PPEF2 是高度近視的致病基因。因此，IF 在鑒定近視及其他眼病致病基因方面表現出巨大作用，為近視基因類標志物的檢測提供了科學方法。

I 型膠原蛋白（type Ⅰcollagen，Col-I）是鞏膜外基質的主要成分，是影響鞏膜重塑的重要因子。Liu 等[19]利用間接IF 檢測Col-Ⅰ、α-平滑肌肌動蛋白和紐蛋白在FDM 豚鼠脈絡膜上的表達情況，利用倒置熒光顯微鏡觀察IF 結果，發現tRF-22 可通過調節脈絡膜血管功能在近視進展中發揮保護作用。有研究使用miRNA-29a 模擬物和其抑制劑轉染人胎兒鞏膜成纖維細胞，應用間接IF 檢測熱休克蛋白47、Col-ⅠA1、Smad3 蛋白等標志物的表達[20]。結果表明，miRNA-29a模擬物抑制了熱休克蛋白47、Col-Ⅰ等蛋白的表達，促進了鞏膜成纖維細胞的凋亡，這表明miRNA-29a會促進鞏膜重塑、加快近視發展，為治療近視的潛在治療靶點研究提供了新見解。一項研究使用抗Col-Ⅰ抗體和熒光標記的二抗對經Hsa-miR-142-3p 模擬劑和抑制劑轉染的人鞏膜成纖維細胞進行間接IF 染色[21]。結果表明，Hsa-miR-142-3p 可以降低Col-Ⅰ的表達水平，可能是控制高度近視的靶點。此外，Hsiao等[22]應用Col-Ⅰ抗體作為一抗，檢測經紫外線A 模擬日光照射后的人鞏膜成纖維細胞Col-Ⅰ的表達，發現紫外線A 可以減少TGF-β 誘導的Col-Ⅰ的產生從而影響近視發展。一項研究予以人鞏膜成纖維細胞660 nm 光照干預，并應用間接IF 檢測HIF-1α 和Col-ⅠA1 蛋白的表達發現660 nm 光照會下調HIF-1α 表達并促進膠原蛋白合成，且不會造成光損傷[23]。有研究應用間接IF 檢測缺氧培養的人鞏膜成纖維細胞中IL-6 的表達，該研究發現鞏膜成纖維細胞在缺氧條件下過量分泌IL-6，并間接抑制鞏膜重塑中鞏膜細胞外基質變薄的過程[24]。

因此，IF 可以被應用于檢測眼組織Col-Ⅰ和其相關蛋白的表達，為探究影響鞏膜重塑和近視進展的因素提供了潛在途徑。

有研究應用IF 檢測透鏡誘導性近視（lensinduced myopia，LIM）和FDM 豚鼠模型視網膜黑視蛋白（melanopsin，MLP）的表達[14]。該研究采用抗MLP 一抗和熒光顯色二抗共同孵育，運用激光共聚焦顯微鏡觀察圖像，結果表明MLP 與近視的發展存在潛在關聯。另有研究向LIM 豚鼠玻璃體腔注射MLP 抗體，使用間接IF 來檢測視網膜MLP 的表達[15]。結果表明，MLP 主要表達在豚鼠光敏感視網膜神經節細胞的表面和樹突上，對LIM 豚鼠近視發展有抑制作用。這表明IF 有助于近視發展過程中有關蛋白標志物的作用研究，為近視治療提供新靶點。

雙調蛋白（amphiregulin，APG）是近視重要的標志物。間接IF 被一項研究用來檢測FDM 豚鼠鞏膜中APG 的相對表達量，觀察圖像發現APG 在FDM 發展過程中表達上調[16]。有研究對原代鞏膜成纖維細胞進行間接IF 染色，抗APG、波形蛋白和角蛋白抗體作為一抗參與孵育[17]。該研究發現，APG 通過ERK1/2-MMP2途徑參與鞏膜重塑，是近視的監測性標志物。有研究者向LIM 豚鼠玻璃體腔注射APG 抗體，兔抗APG 抗體等抗體作為一抗，山羊抗兔IgG 等作為染色二抗檢測豚鼠視網膜APG 的表達[18]。該研究發現，APG 可以抑制眼軸的增長，延緩近視過程中鞏膜變薄，這一發現為進一步研究APG 在鞏膜重塑和近視發生、發展中的作用提供了基礎。

在樣品的測試方面，由于氧化石墨烯元件的濕敏性能的特性，因此為了達到較好的測試效果則在最為合理室溫25攝氏度的環境下進行測試，其測試共測試9種化學溶液，將氧化石墨烯元件置于上方且環境密閉，由此得出測試結果，其測試結果如圖表2。

高等職業院校辦學主要面向地方產業一線，以學生獲得職業技能作為主要培養目標。國務院印發的《關于深化體制機制改革 加快實施創新驅動發展戰略的若干意見》，明確了技術創新市場導向機制、成果轉化激勵政策等，推進了高職院?？蒲泄ぷ鞯陌l展。高職院校依托校企合作辦學，深化產教融合，推進科研成果轉化為社會生產力，對地方產業起到積極的推動作用[1]。然而，我國高職院?？蒲谐晒霓D化率很低，很多科研成果未得到推廣。本文對于高職院?？蒲谐晒茝V的現狀、限制因素進行分析，并研究對應策略，提升高職院?？蒲谐晒D化率。

間接IF 在近視藥物療效研究中有巨大的潛在作用。邱宇等[28]向FDM 豚鼠玻璃體內注射抗新生血管藥康柏西普，兔抗鼠酪氨酸羥化酶多克隆抗體作為一抗進行免疫熒光染色，發現康柏西普會使FDM 豚鼠視網膜中的酪氨酸羥化酶水平降低，并導致豚鼠眼軸延長、屈光度升高。此外，有研究利用間接IF 定位和檢測小膠質細胞標志物Iba1 的表達，并研究中藥駐景丸加減方的療效[29]。FDM 豚鼠被灌胃駐景丸加減方，采用抗Iba1 抗體作為一抗進行IF 試驗，通過熒光掃描顯微鏡攝像系統采集圖像。結果發現中藥干預組豚鼠視網膜Iba1 表達較近視模型組顯著降低，駐景丸加減方可通過抑制小膠質細胞活化抑制視網膜血管病變，從而起到保護視網膜的作用。這些研究表明，IF為中西藥物治療近視的機制和效果研究提供了潛在方法，有利于近視藥物的研發。

連接蛋白36 參與形成間隙連接，是細胞間信息交換的重要媒介。有研究采用間接IF 評估FDM 和LIM 豚鼠視網膜內叢狀層和外叢狀層中連接蛋白36和其磷酸化的量[25]。該研究發現，FMD 豚鼠連接蛋白36 的數量和其磷酸化水平降低，而LIM 則不受影響，這表明FDM 豚鼠視網膜中連接蛋白36 可能通過介導細胞間偶聯參與了近視發展。間接IF 使得人們探究細胞間的偶聯與近視的相關性成為可能。一項研究運用間接IF 檢測LIM 小鼠視網膜中神經元型一氧化氮合酶和S-亞硝基化蛋白的表達[26]。結果發現，在LIM 豚鼠視網膜中這兩種蛋白的表達較正常組降低，一氧化氮介導的非經典蛋白S-亞硝基化修飾可能在近視調節中發揮重要作用。另有研究應用間接IF 檢測了LIM 豚鼠視網膜色素上皮中mTORC1 蛋白復合體的激活情況[27]。激活的mTORC1 與抗磷酸化P70S6激酶抗體結合，被二抗發出的熒光顯示位置。結果表明，mTORC1 可促進眼軸伸長、脈絡膜變薄和視乳頭周圍脈絡膜萎縮，從而促進近視發展，mTORC1 是近視治療手段研究的潛在新目標。

間接IF 也被用來檢測鈣離子在眼組織的表達。Li 等[30]描述了一種監測FDM 小鼠視網膜水平細胞內Ca2+的水平變化的新型鈣熒光系統，抗鈣結合蛋白抗體為一抗，驢抗小鼠Alexa Fluor 555 為二抗孵育，運用GCaMP6+鈣結合蛋白+/鈣結合蛋白+共免疫染色模式來跟蹤GCaMP6+的數量和水平細胞的比例，這為檢測人眼組織中Ca2+及其他離子表達水平提供了新的方法和可能性。

2.3 多重IF 在近視相關生物標志物檢測中的應用

多重IF 是一種利用辣根過氧化酶對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的新興技術。有研究者用M-視蛋白和S-視蛋白多克隆抗體標記小鼠視網膜整體，使用5 色多重熒光免疫染色試劑盒染色進行熒光染色，發現M-視蛋白過表達會破壞正常的屈光發育并導致近視，而M-視蛋白的缺乏可以保護小鼠免受近視，并促使小鼠出現遠視趨勢[31]。多重IF 使得復雜細胞群體和組織微環境的分析更為準確和全面，為近視發病機制和治療方案的研究開辟了新途徑。

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3 小結和展望

IF 可以鑒別近視相關的細胞和高度近視的致病基因，檢測近視相關目標蛋白和離子在眼組織和細胞中的分布和表達情況，探測近視發展中眼組織的缺氧程度和鞏膜重塑的程度，探究近視藥物在體內的機制和效果等。因此IF 在近視研究領域中扮演著重要角色，是極具效益的方法和手段。IF 也具有一定局限性。隨著時間的推移熒光信號會減少或消失，過多非特異性抗體的結合可能無法準確定位免疫復合物，對顯微鏡設備要求較高?？偟膩碚f，IF 可以幫助人們進一步探究近視及其他眼病的機制和治療方案，是近視研究領域不可或缺的手段。隨著科學技術的不斷發展，IF得到不斷的完善，今后該技術將被更廣泛地應用于生命科學更多領域之中。

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