稀釋涂布平板法計數微生物的四大誤區

張艷娟　陳兆亮　郭建坤

稀釋涂布平板法是一種常見的微生物計數方法，該方法通過統計平板上的菌落數推測樣品中活菌個數，其原理是將待測樣品稀釋適當倍數，使樣品中的微生物細胞分散開，再取一定量的稀釋液均勻涂布到固體培養基表面，讓分散開的單個細胞繁殖得到一個菌落，這樣就可以通過肉眼可見的菌落數推理肉眼不可見的微生物細胞數。稀釋涂布平板法計數微生物的計算公式為每克樣品中的菌株數=（C÷V）xM，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用稀釋液的體積，M代表稀釋倍數。學生對該公式的理解存在多種認知誤區，導致此類問題得分率低，現結合典型試題進行分析。

誤區一 對平均菌落數的理解

公式中的C不一定是所有實驗所得菌落數的平均值，為增強實驗說服力和減小實驗誤差，本實驗應設置對照實驗和重復實驗，此實驗的對照實驗是將未涂布菌液的培養基放置在相同條件下培養，其目的是排除培養基污染對實驗結果產生的影響。若空白對照組平板出現菌落，則說明空白對照組的平板被污染，進而推測實驗組平板也可能被污染，這種情況不能直接將實驗組平板的菌落數取平均值，應重新進行實驗，只有空白培養基沒有出現菌落，實驗結果才可信，此實驗的重復實驗是將同一稀釋度的稀釋液至少涂布3個平板（一般設置3-5個平板），選擇菌落數在30-300的平板計算平均菌落數。若重復實驗中某個平板的菌落數與其他差別甚遠，如四個平板的菌落數分別為42、200、256、234，菌落數42與其他數值差異過大，說明該平板操作過程有誤，則該菌落數應舍棄，若舍棄后不足三個平板，不能用菌落數相近的兩個平板取平均值，應找到原因并重做實驗。若計算每克樣品中的某種菌株數，則C應代表某一稀釋度下平板上生長的符合該菌菌落特征的菌落數的平均值，培養基上其他菌種形成的菌落數不能一并計算在內。如檢測1L待測水樣中的大腸桿菌數目只統計大腸桿菌菌落數的平均值。

例1 在5個細菌培養基平板上均接種稀釋倍數為105的土壤樣品溶液0.1mL，培養一段時間后，平板上長出的細菌菌落數分別為13、150、160、170和591，每克土壤樣品中的細菌數量為____個。

解析 應選擇菌落數在30-300的平板計算平均菌落數，舍棄菌落數為13和591的平板，所以平均菌落數為（150+160+170）÷3=160，每克樣品中的菌株數=（C÷V）xM=160÷0.1x105=1.6x108個。

誤區二 對稀釋倍數的判定

平板中菌落數過少會導致計數誤差過大，菌落數過多又會造成計數困難，為確保有效活菌數的準確測定，應合理設定稀釋倍數。待測樣品中微生物數量越多，所需稀釋倍數越大，而微生物數量越少，所需稀釋倍數越小，如測定土壤中細菌數量，一般選用104、105和106倍稀釋；測定放線菌數量，一般選用103、104和105倍稀釋；測定真菌數量，一般選用102、103和104倍稀釋；測定自來水中大腸桿菌數量，一般不稀釋，直接進行涂布培養。人教版高中生物教材給出的樣品稀釋的流程示范是將10g土樣加入到90mL無菌水中得到稀釋10倍的樣液，從稀釋10倍的樣液中取1mL加入到9mL無菌水中得到稀釋100倍的樣液，依次類推（圖1）。若取6g土樣配制成稀釋10倍的土壤溶液，則土壤占混合液的10%，土壤溶液總量為60mL，應添加54mL的無菌水。若取Ig土樣配制成稀釋100倍的土壤溶液，則土壤占混合液的1%，土壤溶液總量為100mL，應添加99mL的無菌水。

例2 佩戴口罩是預防病原體感染的有效措施之一。使用過的口罩，如果沒有妥善處理會對生態環境造成巨大威脅，某科研團隊欲從不同環境的土壤中篩選出能高效降解一次性口罩（主要成分是聚丙烯纖維）的細菌，請回答下列問題：

（1）運用圖2所示方法對土樣中的細菌計數，分別在3個平板上滴加0.1mL稀釋液，經適當培養后，3個平板上菌落數分別是65、66和67，則1g土壤中的活菌數約為____個。

解析 本題的關鍵是根據圖示判斷稀釋倍數，將1g土樣加入到99mL無菌水中，相當于直接將土樣稀釋了100倍，再從稀釋100倍的樣液中取1mL加入到9mL無菌水中得到稀釋1000倍的樣液，到圖中的第四個試管，土樣已經被稀釋106倍，則每克樣品中的菌株數=（C÷V）×M=（65+66+67）÷3÷0.1×106=6.6×108個。

誤區三 對體積與質量的單位換算

微生物計算公式中的V代表涂布平板時所用稀釋液的體積，通常為0.1mL，但若待測樣品中微生物數目較少，接種0.1mL經培養后平板上菌落數達不到30，可增大接種量（如接種1mL）。試題中經常改變涂布平板時所用的稀釋液和所求樣品的體積和質量，要注意做好單位換算，如1cm3=103μL=1mL=10-3L體積和質量的換算公式是體積=質量÷密度（v=m/ρ），水的密度是1g/cm3，則質量為1g的水的體積是1cm3即1mL。

例3 牛、羊等反芻動物具有特殊的器官——瘤胃，在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。圖3是研究人員從瘤胃提取物中獲得尿素分解菌的流程。

（1）實驗中初步估測甲瓶中細菌數為3×106個/mL，若要在每個平板上涂布100μL稀釋后的菌液，且保證每個平板上長出的菌落數不超過300個，則至少應將甲瓶的菌液稀釋____倍。

解析 1μL等于10-3mL，涂布100μL菌液則涂布0.1mL.設至少應將甲瓶的菌液稀釋X倍，則300÷0.1x10x=3×106，計算可得X=3，即至少應將甲瓶的菌液稀釋103倍。

誤區四 對統計誤差的分析

從稀釋涂布平板計數的原理分析，運用該方法統計的菌落數往往比活菌的實際數日低，因為樣品一般不易完全分散成單個細胞，當兩個或多個活細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，從稀釋涂布平板計數的過程分析，稀釋倍數是否合適、涂布是否均勻、培養環境是否能保證微生物正常生長、計數是否存在漏計或重復計數等情況都會影響統計結果。除此之外，還要考慮培養時間對菌落數目的影響，菌落數目需要每隔一段時間統計一次，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，防止因培養時間不足遺漏菌落的數目。

例4 中國科學家運用合成生物學方法構建了一株嗜鹽單胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的廢棄液，含較多蔗糖）為原料，在實驗室發酵生產PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整體利用價值，工藝流程如圖4，請回答問題。

（1）為提高菌株H對蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液體培養基中將蔗糖作為____，并不斷提高其濃度，經多次傳代培養（指培養一段時間后，將部分培養物轉入新配的培養基中繼續培養）以獲得目標菌株。培養過程中宜采用____法對樣品中的活菌進行接種和計數，以評估菌株增殖狀況。若某次取樣中，對菌液稀釋了105倍后，在每個平板上涂布菌液的體積為0.1mL，平板上的平均菌落數為220個，則菌液中H菌的細胞數為____個/L.菌落數目需要每隔一段時間統計一次，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣做的目的是____。

解析 該研究的目的是提高菌株H對蔗糖的耐受能力和利用效率，結合微生物的代謝需求，其液體培養基應該以蔗糖作為唯一碳源。稀釋涂布平板法可以用于統計樣品中的活菌數目，菌液中H菌的細胞數=（C÷V）×M=220÷0.1×105=2.2×108個/mL=2.2×1011個/L.選取菌落數目穩定時的記錄作為結果是為了防止因培養時間不足而導致遺漏菌落數目，增加實驗結果的可信度。

基金項目：河北省教育科學“十四五”規劃課題“基于核心素養的高中生物學深度學習研究”階段性成果，No。2103372）

（收稿H期：2024-02-03）