基于“肝主疏泄”調控RPE細胞自噬探討從虛瘀同治角度論治干性黃斑變性的機制*

張昭,董洋,王莉,梁鳳鳴

1.天津中醫藥大學第一附屬醫院/國家中醫針灸臨床研究中心,天津 300193; 2.中國中醫科學院廣安門醫院濟南醫院,山東 濟南 250002

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是55歲以上人群中心視力喪失的主要原因,常累及患者黃斑結構和功能,其典型病理特征為細胞外沉積物(玻璃膜疣、基底線/板狀沉積),可顯現新生血管或萎縮。流行病學報告,我國AMD患者總數已超過500萬,本病已成為我國防盲治盲和公共衛生工作的重點[1-2]。AMD分為早、中、晚三期,晚期又分為滲出性(濕性)和萎縮性(干性)兩類,最終分別演變為盤狀瘢痕及地圖樣萎縮[3]。目前,抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為濕性AMD的一線治療藥物已得到廣泛認可,但對干性AMD病變進展仍無行之有效的干預療法。研究發現,視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細胞自噬不足在AMD發病中起到至關重要作用,提出干性AMD自噬靶向治療研究[4]。中醫認為,“肝主疏泄”推動全身氣血津液運行,促進瘀積產物排泄的過程與RPE細胞自噬過程一致,是人體維持正常代謝的關鍵一步。所以,基于“肝主疏泄”理論分析RPE細胞自噬功能或為中醫藥治療干性AMD提供新思路和新靶點。

1 “肝主疏泄”是干性AMD發生發展的理論基礎

肝主疏泄功能正常對其他臟腑至關重要,如《雜病源流犀燭·肝病源流》所述:“肝和則生氣,發育萬物,為諸臟之生化?！备螝馍l,諸臟之氣生升有由,則氣血沖和,五臟安定,生機不息。從生理方面分析,“發生之紀,是謂啟陳,土疏泄,蒼氣達,陽和布化,陰氣乃隨,生氣淳化,萬物以榮”(《素問·五常政大論》)。從病理方面分析,“人之五臟,惟肝易動難靜。其他臟有病,不過自病……惟肝一病,即延及他臟”(《知醫必辨》)。筆者認為,肝疏通暢達,宣泄升發才能使氣血津液運行通暢,代謝產物而不致瘀積;若肝失疏泄則百病由生。

1.1 “肝主疏泄”釋義“疏泄”一詞最早見于《素問·五常政大論》,朱丹溪《格致余論》提出:“主閉藏者腎也,司疏泄者肝也?！备沃魇栊沟闹行沫h節是調暢氣機,具體包括維持氣血津液輸布、協調脾升胃降、調暢氣機、促進膽汁分泌等[5]。肝主疏泄是人一身之氣正常運行的重要調控環節,亦是人體一切生命活動的基礎。肝失疏泄則導致氣血津液運行失常等各種生理機能障礙。從微觀看,細胞是最基本的功能單位,人體所有生理機能障礙皆與細胞內的物質能量代謝失常有關。自噬作為細胞內物質循環代謝的重要環節,該功能過度激活或抑制會影響細胞生理功能。因此,“肝主疏泄”與細胞自噬具有很大相似性,肝失疏泄的病機變化勢必會在細胞層面得以體現[6]。由此可見,自噬是肝主疏泄在微觀層面的具體體現,肝主疏泄又是人體能量代謝平衡的先決條件。

1.2 “肝失疏泄”是干性AMD發生的重要原因中醫并無“AMD”這一病名,根據癥狀體征,將其歸為“視瞻昏渺”范疇。視瞻昏渺是因虛致病,本虛標實,虛實錯雜的疾患,按病因可分為虛實兩類:虛證者多因勞思竭視,耗傷氣血,或肝腎虧虛,目失濡養,或陰虛火炎,灼爍津液以致神光暗淡。實證者多為內生痰瘀遮蔽神光致使目昏不明?！端貑枴そ饏T真言論》曰:“目受血而能視?！庇帧案螝馔ㄓ谀?肝和則目能辨五色”(《靈樞·脈度》)?！稄埵厢t通》則云:“氣不耗,歸精于腎而為精,精不泄,歸精藏于肝而化清血?！北静〔∥辉谝曇?與肝腎二臟密切相關。玻璃膜疣為干性AMD的特征性表現,RPE細胞老化,自噬功能下降,補體系統被激活,脂褐質、補體膜攻擊復合物和炎癥物質沉積于RPE細胞基底層,玻璃膜疣形成,AMD病情進一步加重[7]。中醫認為,玻璃膜疣為氣血虛弱,肝腎虧虛,機體功能衰老的病理產物,屬于“瘀結”,治療時應采用補虛兼化瘀之法[8]。肝主疏泄功能正常,血行通暢目竅才能視物,瘀積清除神光方可發越。由此可見,從“虛瘀同治”論治視瞻昏渺,或可成為中醫治療干性AMD的關鍵所在。

2 “肝失疏泄”是視網膜色素上皮細胞自噬不足的重要前提

中醫藏象學說對眼科臨床具有指導意義。眾所周知,“五藏”絕非等同于西醫實體器官的“五臟”,中醫的藏象學說與細胞結構實質上是一種“微觀”與“宏觀”相結合的學說。隨著中醫理論與現代醫學前沿的細胞生物學相結合,中醫與現代醫學理論實現真正意義上的融合,如藏象之肝、腎、脾、分別與配體-受體-信號轉導系統、染色體、線粒體對應[9-11]。研究發現,“肝”在宏觀層面是神經、內分泌系統,在細胞層次即為配體-受體-信號轉導系統[12]。神經末梢釋放的遞質和內分泌細胞分泌的激素,從根本上說都屬于細胞信號,它作用于靶細胞受體,激活細胞內的第二信號系統,進而產生細胞內一系列特異性生理應激改變,集體應激改變則形成宏觀的生理進程。肝體陰而用陽,司疏泄,具有啟迪諸臟,調暢氣機的作用。這與在細胞間傳遞信息的神經遞質、激素作用特點相似,起著激發和調節靶細胞生理功能的作用?？梢?無論從細胞生物學還是中醫理論分析,視網膜作為神經系統一部分自然受“肝主疏泄”調控。

龐贊襄老先生認為:“人之臟腑……五官九竅皆非實體,而內涵脈道孔竅,氣血循環往來其中?！薄澳磕司鸥[之一,皆賴氣血以滋養,然氣血以和暢為順,少有怫郁,則目病叢生?！闭Ｇ闆r下,氣機運行,氣載津血,津血因氣而運,三者相互維系,循環不已。肝經的玄府暢通,肝氣即可上升,目中即有主宰,五臟之精,各展其用,終能分辨五色。若肝失疏泄,厥陰經絡玄府瘀閉,一方面,導致機體生成的營養物質無以充養目竅,視衣功能活動減退;另一方面,網膜水液輸布異常使得痰濁、血瘀等病理產物沉積而形成玻璃膜疣。痰濁血瘀等病理產物的存在,進一步阻礙氣血津液的正常運行,繼續加重細胞自噬不足狀態,形成疾病虛實夾雜的惡性循環。

3 自噬不足是干性AMD發生發展的重要標志

自噬指溶酶體對細胞內大分子物質以及受損細胞器進行降解、重新利用的過程。自噬分小自噬、大自噬和分子伴侶介導的自噬,其中大自噬是RPE細胞自噬的主流。自噬通過清除細胞質內已經受損的細胞器以及代謝產物,重構亞細胞水平,使細胞處于健康狀態,并對受損的細胞進行保護[13]。RPE細胞有典型的自噬能力,起到“清道夫”作用,其自噬活性降低可以導致視網膜異常蛋白及脂褐素的積累,引發活性氧產生和蛋白質聚集。這些物質不僅導致脂褐素形成,同時激活炎癥反應,加速細胞衰老,進一步加快AMD進程[14]。自噬與干性AMD的關系具體歸納如下。

3.1 自噬、免疫炎癥反應與干性AMD研究表明,諸如炎癥小體生成,補體途徑等免疫炎癥反應參與了干性AMD的病理進程[15]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor containing pyrin domain 3,NLRP3)是由凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD domain,ASC)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific protease-1,Caspase-1)共同組成的多蛋白復合物。生理條件下,當RPE細胞受危險信號刺激時,NLRP3可通過ASC招募Caspase-1,并使其成熟,最后誘導白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18分泌,促進炎癥的發生,造成細胞凋亡。玻璃膜疣本質上是細胞外的顆粒蛋白質聚集體,亦是NLRP3介導的無菌炎癥反應的激活劑。自噬作為一種免疫機制能調節免疫炎癥首先體現在去除NLRP3激活因子,減輕炎癥小體激活和炎性反應[16]。自噬也可以通過保護線粒體完整性,減少線粒體DNA向胞漿釋放,進而抑制NLRP3激活[17]。

3.2 自噬、氧化應激與干性AMD自噬可以通過調控脂褐素沉積等病理改變減輕RPE細胞損傷,進而延緩疾病進程。正常生理條件下,RPE細胞需要大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)滿足代謝及信號通路需求,抗氧化酶如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等維持細胞內ROS的生成與清除平衡。而黃斑區匯集網膜最高血流量,這使該區RPE細胞始終處于高危環境中,一旦氧化應激失衡,ROS產生過多或抗氧化酶活性下降即會造成RPE細胞損傷,進而產生相應病理改變。Baek等[18]研究發現,自噬和氧化應激相互影響與暴露時間相關,如短期暴露在低劑量氧化應激條件下,RPE自噬水平顯著提升以清除氧化損傷的細胞器;相反,慢性氧化應激會使自噬水平下降,穩態無法維持,同時自噬的下調使RPE細胞更易受氧化應激影響而凋亡,進而導致AMD發生。此外,氧化應激能產生脂褐素,其主要成分為N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(N-retinyliden-N-retinylethanolamine,A2E)。張晶晶等[19]發現,A2E會刺激人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19細胞)分泌多種AMD相關炎癥因子和新生血管因子,誘導ARPE-19細胞的自噬?？梢?在氧化應激的過程中,自噬能通過抑制ROS的產生延緩本病發生。

雷帕霉素靶向蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路是RPE細胞自噬調控的重要信號通路。生理條件下,活化的mTORC1抑制自噬的發生,當細胞受到營養不足、缺氧、氧化應激等不利因素刺激下,mTORC1就會啟動自噬發生。PI3K/ AKT信號是自噬負調控因子,位于mTOR分子的上游,當自噬啟動后,早期自噬小體膜形成。而自噬體膜封存依賴于微管相關蛋白1輕鏈3 (LC3),LC3-Ⅱ 則為自噬活性的重要標志分子[20]。LC3-Ⅱ特異性招募p62參與對自噬底物的選擇,泛素結合蛋白p62有一個特殊的區域命名為LC3識別序列。p62作為自噬特異性下游底物被自噬-溶酶體通路降解,降解過程通過與LC3相互作用實現[21]。p62又通過信號傳導選擇自噬受體,對自噬效應調控。本課題組正以RPE細胞自噬為切入點,對RPE細胞活力、信號通路蛋白mTOR、自噬標志性蛋白LC3、上游因子PI3K/Akt、下游底物p62等相關因子表達進行對照研究,觀察對RPE細胞自噬功能的靶向保護作用,以期探明杞黃顆粒治療干性AMD的理論依據。

4 中醫藥調節自噬功能治療干性AMD

《證治準繩》認為:“若年過五十意外而昏者……天真日衰,自然目光漸謝?！贝颂幪煺婕礊槟I之精氣。而肝腎同處下焦,腎藏精,肝藏血,血從精化,是謂“乙癸同源”。若肝腎之精日漸衰微,視衣失其所養,則視瞻功能減退。西醫認為,RPE細胞代謝和衰老與AMD密切相關,而RPE生理功能正常依賴視網膜血供維持營養所需?！皟任遢唽W說”認為,RPE屬于腎[22],同時“肝主藏血,肝受血而能視”,故治療本病應注意“補虛化瘀”。筆者認為,肝體陰而用陽主動,腎主陰水而主靜,肝陰腎水即為一體,而“肝主疏泄”,氣血上注于目,因而明目必先養血柔肝。而肝疏泄條達依賴于腎水的滋養[23],木得水養,則疏泄有度,氣機暢達,目中玄府通利,氣血津液上承目竅,神光方可發越無阻,實現“肝氣和則目能辨五色”。

杞黃顆粒是梁鳳鳴教授治療AMD的經驗復方,主要成分為枸杞子、楮實子、茺蔚子、丹參等,具有補益肝腎、化瘀祛痰之功。本課題組分別于2000年制成口服液“枸杞明目液”,2005年制備成“枸杞明目方”免煎劑院內協定處方,之后進一步改變劑型為杞黃顆粒,處方藥物組成保持不變;并從臨床療效、視網膜光損傷病理、CFH基因多態性及VEGF上下游調控因子等多方面進行研究[24-28],顯示該藥對于干性AMD治療效果明顯優于濕性AMD。全方配伍精當,標本兼治,切中視瞻昏渺虛實夾雜之特點,或可成為治療本病發生發展、提高患者視力水平的選擇。

5 結語

干性AMD發病率高,因其表現為中心視力進行性損害,不易引起人們重視。若病情進展至晚期會對患者的視力健康和生活質量構成嚴重威脅。目前,臨床并無公認的治療干性AMD的藥物,臨床普遍推薦使用抗氧化維生素和礦物質等,但療效欠佳。RPE細胞自噬不足與AMD發病關系密切,自噬機制及其靶向干預成為治療干性AMD研究的前沿熱點?；谛枨髮蚣爸嗅t藥治療干性AMD的臨床優勢,筆者總結幾代師承經驗,應用杞黃顆粒方(駐景丸加減方化裁)積累了比較扎實的臨床基礎和良好的研究基礎。在未來,課題組結合“肝主疏泄”的中醫理論基礎,切中本病“虛中夾瘀”之病機,擬通過藍光誘導大鼠視網膜損傷及RPE細胞自噬功能損傷,觀察中藥復方對RPE細胞mTOR自噬通路的干預機制,進一步闡明杞黃顆粒治療干性AMD的科學理論,以期更好地服務于臨床。