石墨烯及其衍生物的理化性質和應用研究進展

鄺一深 綜述 李祥偉 審校

近年來,石墨烯及其衍生物憑借其獨特的物理、化學和生物學性能被廣泛運用于生物醫藥載體、腫瘤治療及組織工程等領域。其中,組織工程是利用干細胞、生長因子和支架修復組織缺損并恢復組織生理功能的過程。支架支持干細胞特異性分化為骨、血管和神經等組織,因此,支架在組織工程中具有至關重要的作用。石墨烯及其衍生物被廣泛應用于組織工程領域。本文對石墨烯及其衍生物的理化性質和生物學研究進展進行綜述。

1 石墨烯(Gp)的理化性質

石墨由蜂窩狀的平面碳原子層層有序排列堆疊而成,而石墨烯是通過機械分離方法從石墨中分離出來,是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成的六角型平面多環芳香烴原子晶體[1],也是世界上最薄(只有一個碳原子厚度)、最堅硬的平面薄膜納米材料[2],具有高導熱系數、高電子遷移率、低電阻率、高機械強度、高比表面積和低密度等特點[3]。同時,石墨烯具有良好的力學性能,彈性模量達到1 TPa,壓縮強度為45 GPa,是理想的高強度材料[4],因此,在電子、航天、光學、力學和儲能等領域,石墨烯具有廣闊的應用前景。

石墨烯的衍生物有氧化型 (G0)、還原型(rG0)、氟化型和氮化型石墨烯等。在醫學領域,研究和應用較多的是氧化石墨烯,因其表面帶有大量親水性含氧官能團,具有良好的生物相容性和溶液中穩定性[5],同時,通過化學修飾石墨烯,產物具有更多功能而被應用于更多領域[6]。石墨烯及其衍生物在醫學領域的應用受到廣泛關注,由于獨特的物理和化學性質,常被應用于基因或藥物載體構建、生物檢測、腫瘤治療、抗菌材料研制和組織工程等方面[7-8]。

2 石墨烯及其衍生物的改性修飾和作用

與不同材料結合后,石墨烯及其衍生物的修飾產物的性質會得到進一步優化,與金屬納米顆?；蛴袡C材料結合可增強抑菌、改善物理性質和生物相容性等。

2.1 石墨烯及其衍生物與金屬納米顆粒復合

有研究者利用石墨烯/氧化鋅(GZNC)納米復合材料構建種植體涂層,研究表明,GZNC可有效抑制種植體周圍形成生物膜、降低變形鏈球菌的致齲性和納米復合材料的毒性,因此,GZNC可成為一種抗菌性種植體涂層材料。如將GZNC應用于臨床,還需要明確涂層的穩定性[9]。氧化石墨烯-銀(GO-Ag)和 L-半胱氨酸功能化修飾氧化石墨烯(GO-L-cys-Ag)納米復合材料在非常低的劑量下,對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有較高的抗菌效果。進一步研究表明,GO-Ag 和 GO-L-cys-Ag對革蘭氏陰性菌的殺菌機制是該復合材料破壞細菌細胞壁或細胞膜的完整性,而對革蘭氏陽性細菌的抑菌作用機制則是抑制細菌細胞的分裂[10]。鈦表面氧化石墨烯攜載鹽酸米諾環素涂層(M@GO-Ti)表現出緩釋特征,并對需氧菌表現出優異的抑制作用,對兼性厭氧菌和厭氧菌具有觸殺和釋殺的協同作用。同時,在體外,可促進人牙齦成纖維細胞(HGF)增殖,這說明在有金黃色葡萄球菌存在的情況下,人牙齦成纖維細胞在M@GO-Ti 具有較高的細胞黏附效率,這對臨床種植修復具有重要意義[11],有望應用該材料促進種植體周圍良好的軟組織封閉作用。研究發現,經微弧氧化的鈦合金結合1.0 mg/mL氧化石墨烯復合物(Ti-MAO-1.0 mg/mL GO)可以顯著增強人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)在Ti表面的黏附、增殖和牙源性分化,該復合材料也具有抗菌活性。微弧氧化(MAO) 涂層具有多層、多孔結構, 結合GO的物理和化學性質有助于封閉牙髓環境和修復牙體結構,具有潛在的臨床應用價值[12],可作為封閉牙髓再生環境和恢復牙體合面咬合形態的修復材料。

2.2 石墨烯及其衍生物與有機功能結構的復合

與羥基磷灰石(hydroxylapatite, HA) 相比,還原型氧化石墨烯/氟羥基磷灰石(rGO/FHA)復合材料的硬度和斷裂韌性分別提高了86% 和137%。進一步研究證實, rGO和F-離子的共同作用可促進成骨細胞增殖和分化。此外,rGO/FHA具有抗菌作用。這為rGO/FHA在臨床中用作種植體的修飾材料奠定了理論基礎[13]。另有研究表明,添加HA和改性GO 可以提高聚乳酸(poly lactic acid, PLA)基納米復合材料的疏水性,而且,聚乳酸/羥基磷灰石/氧化石墨烯(PLA/HA/GO)復合材料的拉伸強度隨著GO含量的增加而增強,具有優異的力學性能[14]。此外,HA添加GO和碳納米管(carbon nanotubes, CNT)可顯著改善HA的表面潤濕性、硬度和粗糙度[15],因此,氧化石墨烯/碳納米管/羥基磷灰石(GO/CNT/HA)復合材料可作為骨移植材料的替代品。

3 石墨烯及其衍生物的細胞學作用

石墨烯及其衍生物對不同干細胞具有不同的促分化作用,如可以促進成骨分化、神經、肌肉、血管分化和礦化等。

3.1 促進干細胞成骨分化

有研究發現,無論是在沒有添加任何骨誘導劑的基礎培養基還是在成骨培養基中,還原型石墨烯羥基磷灰石(rGO-HAp)復合物均可促進人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)及骨祖細胞的成骨分化。提示,在沒有炎癥反應的情況下, rGO-HAp 復合物能夠顯著促進全層顱骨缺損的新骨形成[16],該材料可作為顱骨缺損的修復材料。通過聚乙烯亞胺功能化的氧化石墨烯(GO-PEI)可明顯促進hMSCs增殖和黏附,并且具有高效誘導干細胞成骨分化和殺菌作用[17-18]。因此, GO-PEI能夠用于制備可生物吸收性修復材料,應用于骨折固定、組織工程和牙齒矯正等。與地塞米松(DEX-Control)和還原型石墨烯-地塞米松(DEX-rGO-Ti)的培養基相比, hBMSCs在氧化型石墨烯-地塞米松鈦表面(DEX-GO-Ti) 的增殖率更高, 而且成骨分化更顯著[19]?？梢?表面負載DEX-GO的鈦酸鹽涂層賦予了鈦種植體良好的生物學活性,為鈦種植體的改性修飾提供了理論依據。另有研究發現, GO可促進山羊BMSCs增殖和成骨分化,并具有良好的生物相容性[20], 2D Gp和 3D Gp可促進牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)成骨分化[21],因此,石墨烯可考慮作為骨組織再生的基質。與Na-Ti基質相比,PDLSCs在GO-Ti基質上顯示出更高的增殖率、ALP活性和成骨相關基因的表達水平[22]。因此,GO-Ti在骨組織工程領域具有潛在的應用前景。

3.2 促進細胞成神經、成肌分化

另有研究發現,不同形式的氧化石墨烯、部分還原型石墨烯和完全還原型石墨烯對多巴胺能(dopaminergiccells, DA)神經細胞具有不同的影響和作用,而且,關于抑制細胞增殖和促進神經元分化作用,薄膜狀石墨烯比粉末狀石墨烯作用更顯著。部分還原型氧化石墨烯薄膜(PRGO-film)最適合DA神經細胞培養,因為它能夠促進小鼠多巴胺能神經細胞(SN4741)中腦DA表達,而且不影響細胞代謝或線粒體功能, PRGO-film對DA神經細胞具有保護作用。因此,PRGO-film是一種具有潛在應用前景的支架材料,有研究者將該材料應用于帕金森病DA神經細胞替代治療的探索研究[23],具有高度褶皺結構的GO薄膜有利于細胞形成更大的黏附區和更高水平的成肌分化率。此外,苯丙氨酸和賴氨酸功能化的GO薄膜比單純的GO薄膜顯著提高小鼠成肌細胞(C2C12)成肌分化率[24]。

3.3 促進牙髓再生

低濃度的GO-Cu(<10 mg/mL)可促進牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)的活力、增殖、誘導成牙分化和神經血管形成[25]。GO可促進DPSCs黏附、增殖并可促進礦化相關基因表達[5],可見,GO-Cu是一種頗具潛力的牙髓再生材料。另有研究表明,氧化石墨烯量子點(graphene oxide quantum dots, GOQDs)可以促進人脫落乳牙干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHEDs)黏附、增殖和早期成骨相關基因表達[26]。3D石墨烯泡沫和58 s生物活性玻璃復合(3DGF/58SBG)構建的支架具有較大的表面積、良好的生物學作用和電活性,該支架可通過較強的生物電刺激促進細胞黏附、增殖和分化,進而顯著促進骨再生[27],說明,石墨烯作為再生載體或支架材料,但需要篩選和明確適宜的濃度。

牙髓位于髓腔內,被牙本質包繞,通過根尖孔、側支根管及副根管于牙周組織相連。牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)由Gronthos等[28]于2000 年首次發現,與骨髓間充質干細胞具有極其相似的免疫表型和形成礦化結節能力,細胞形態呈梭形,可自我更新和多向分化,具有較強的克隆能力,存在于牙髓核心和細胞富集區。研究表明,DPSCs具有分化為成牙本質細胞、成骨細胞、脂肪細胞和神經樣細胞等潛能,是牙髓再生常用的種子細胞[29]。組織工程涉及干細胞、支架和生長因子三大部分。石墨烯及其衍生物可促進DPSCs黏附、增殖和分化。體外實驗中,檢測DPSCs黏附能力的方法主要有通過掃描電鏡來觀察細胞特征,通過RT-PCR或是檢測細胞黏附相關的整合素β1的表達情況[30]。

石墨烯及其衍生物可促進DPSCs黏附不同基底黏附,若欲將DPSCs作為牙髓再生的種子細胞,在進行體外實驗檢測細胞學作用時,需將其接種于牙本質表面或相關支架材料上,通過觀察DPSCs的成骨、成血管和成神經分化等效果,以判斷DPSCs的自我更新和多向分化能力,DPSCs黏附牙本質片或相關支架材料的效果將決定牙髓再生的效果[5,25-27]。若將DPSCs直接置入離體牙根管內進行牙髓再生,到達根管的DPSCs數量有限,而且其在根管內分布不均勻,因此很難再生完整的牙髓組織[31]。所以,探索可輔助細胞黏附根管壁進而促進細胞黏附和分化的措施一直被研究者們的努力方向。石墨烯及其衍生物是否能夠改善DPSCs黏附牙本質,進而使DPSCs均勻分布于根管內壁表面,這有待進一步研究。

4 展 望

石墨烯及其衍生物在牙科種植體、骨缺損的修復和再生領域已有較多基礎研究和臨床運用研究?；诓煌男揎椃绞?、應用形式、材料濃度,石墨烯及其衍生物具有不同的細胞學作用和細胞毒性,其適當應用可優化基底表面性質,增強抑菌作用、促進干細胞黏附、增殖和分化,而關于石墨烯及其衍生物在牙髓再生中黏附效果有待進一步研究和探討。