人類外周神經在化學萃取前后的組織形態變化研究

賴英榮　朱慶棠　劉小林

【摘要】 目的 研究人類外周神經在化學萃取前后的組織形態變化，探討化學萃取法制備人類長段粗大去細胞神經的可行性。方法 用Triton X-100和脫氧膽酸鈉對人體長段脛神經作不同次數的萃取處理，經常規HE染色、砂羅鉻花青、網狀纖維組織化學染色和S-100免疫組織化學染色后，在光鏡下觀察神經萃取前后的組織形態變化，并比較不同萃取次數對神經結構的影響。結果 人體長段脛神經經2次萃取后，其軸突、髓鞘、許旺細胞及其他結締組織中的細胞均已消失，僅見網格纖維，而神經基底膜管、神經束膜等纖維性支架保存完整，與未經萃取的神經相仿。萃取1次者仍殘留少量細胞碎屑，而萃取3次者，細胞清除更徹底，但纖維性支架結構明顯破壞。結論 人類長段粗大神經干經化學萃取后不含細胞，而保留有完整的纖維性支架結構?；瘜W萃取法制備人類長段粗大去細胞神經可行。

【關鍵詞】 外周神經;人類;化學萃取;組織形態

Study on the histomorphology of human peripheral nerve treated with chemical extraction

LAI Ying-rong, ZHU Qing-tang,LIU Xiao-lin.

Department of Pathology Ist Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080 China

【Abstract】 Objective To investigate the histomorphology of human peripheral nerve treated with chemical extraction, and assess the feasibility of preparing human acellular nerve graft through chemical extraction. Methods Long segments of human tibia nerve were treated with Triton X-100 and sodium deoxycholate for different times. The nerves were sectioned, stained with HE, myelin (Page), reticular fiber (Gordon-Sweet), and S-100, and then examined under light microscope. The histomorphology of the nerve extracted for different times were compared.Results Extracted for 2 times, the axons, myelin, Schwann Cells and other cells in the connective tissue disappeared, while the reticular fiber, neural basal membrane tubes and perineuriums were preserved. The fiber framework of the extracted nerve was similar to that of the nerve prior to extraction. Cell debris was found in the nerve extracted for 1 time. When the nerve was extracted for 3 times, cells were removed completely. However, the fiber framework was destroyed. Conclusions Extracted with chemical agents, the cells in the long and thick human peripheral nerve are removed, while the fiber framework can be preserved. Human acelluar nerve can be made through chemical extraction.

【Key words】 Peripheral nerve;Human;Chemical extraction;Histomorphology

近年來隨著人工材料在生物醫學領域的廣泛應用，人們不斷嘗試用人工合成的材料或生物材料制成神經導管，作為神經的再生通道，但受到材料加工技術的限制，至今仍未能制成具有周圍神經復雜三維結構支架。自Dumont等^［1］和 Sondell等^［2］報道用化學萃取法可去除大鼠坐骨神經中的細胞而保留神經基底膜管以來，人們還用類似方法制備了兔、犬和猴的去細胞神經^［3-5］。這種方法既除去了神經中的抗原成份，降低神經免疫原性的同時又保留了神經復雜的三維支架結構，為制備仿生化的人工神經支架材料開辟了新途徑^［6,7］。本文參照Sondell等的方法處理人類長段粗大的外周神經，通過觀察其大體及組織形態學上改變，探討該方法能否制備長段粗大的去細胞神經支架，為以后制備具有人類神經天然結構的仿生化神經提供實驗依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 人體周圍神經的來源與萃取

人體神經取自一大腿創傷性截肢患者捐獻的廢棄肢體，切取其脛神經，自股骨髁至內踝全長40 cm。將神經截成4段，每段10 cm，直徑為6 mm，取其中3段神經按下列步驟進行萃取，余下的新鮮神經作對照。①在10倍手術顯微鏡下剪去神經周圍的脂肪和部分神經外膜，保留神經束以及連接神經束的部分外膜;②用1000 ml蒸餾水泡6 h，每2 h換液1次;③放入300 ml 3%TritonX-100溶液中，室溫下靜置12 h;④在1000 ml蒸餾水中震蕩、漂洗3遍，10 min/次;⑤放入4%脫氧膽酸鈉溶液中，室溫下震蕩24 h;⑥在1000 ml蒸餾水中震蕩、漂洗3遍， 10 min/次。每次萃取均重復步驟③~⑥，3段神經分別萃取1、2、3次。

1.2 標本的處理

神經萃取后于其中段切取1 cm長的組織，另取1 cm長的新鮮脛神經作對照。標本用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，分別進行HE染色、組織化學染色砂羅鉻花青染色和網狀纖維染色以及S-100免疫組織化學染色。光鏡下觀察神經萃取前后其組織形態的變化。

2 結果

2.1 大體上觀察 新鮮神經外觀完整，豐滿堅韌富有彈性，萃取后的神經疏松，乳白色，質地柔軟。

2.2 光學顯微鏡下觀察 ①HE染色，未經萃取的神經可見神經軸突、許旺細胞、束膜細胞、成纖維細胞，以及散在分布的細胞，經1次萃取后仍隱約見個別許旺細胞以及成纖維細胞，縱橫切面神經結構完整，清楚。經2次萃取后，神經內見不到細胞，藍染的細胞核消失，神經內僅見網格纖維，縱橫切面神經結構基本完整。經3次萃取后，神經內所有細胞消失，橫切面見神經皺縮，結構破壞，縱切面見神經束散亂；②砂羅鉻花青染色，未經萃取的神經，神經髓鞘被染成鮮藍色，紅細胞深藍色，膠原纖維鮮紅色，細胞核和核仁藍色，經萃取1次、2次、3次后的神經砂羅鉻花青染色均為陰性；③網狀纖維染色，未經萃取神經，可見網格纖維及細胞核，而萃取后的神經只見網格纖維，細胞核則未見顯示；④S-100染色，未萃取神經呈陽性，經1次萃取后的神經，橫切面見神經內出現少量棕色的陽性反應信號，經2次萃取后的神經內基本看不到陽性反應信號，經3次萃取后神經內檢測不到陽性反應信號。

3 討論

近年來，隨著人工材料或生物材料在生物醫學領域的廣泛應用，人們不斷嘗試用人工合成的材料或生物材料制成神經導管，作為神經再生的臨時通道。周圍神經損傷后,再生軸突在物理性通道的引導下通過神經缺損區，同時需要許旺細胞分泌多種因子促進其再生。自體神經有完整的神經基底膜管作為再生通道，是修復神經缺損的理想材料，但自體神經來源有限，且會產生新的神經損傷。異體或異種神經雖有完整的神經基底膜管，但異體(種)神經移植往往會因排斥反應而失敗。外周神經主要含有構成神經纖維的軸突、髓鞘和許旺細胞，構成血管的細胞以及神經束的神經束膜細胞和外膜細胞，這些細胞具有強免疫原性，是引起異體（種）神經移植排斥反應的主要物質。Dumont等和Sondell等先后報告了用不同的化學藥物清除大鼠周圍神經中的細胞、髓鞘及其崩解碎片的方法^［1,2］?；瘜W萃取法制備大鼠10 mm長的去細胞坐骨神經獲得成功，神經萃取后僅剩下神經基底膜管和神經結締組織中膠原成份，其免疫原性大為降低。但此方法能否去除長段、粗大的人類外周神經中的細胞，仍有待摸索。本實驗參照Sondell等方法來萃取10 cm長、直徑為6 mm的脛神經，詳細研究了不同萃取次數后神經在大體、常規HE、組織化學和免疫組織化學檢測所見的形態變化。萃取1次神經內殘留少量細胞碎屑，萃取2次仍有極少量S-100殘留而基底膜管和神經束膜等纖維性支架完整，萃取3次，破壞神經支架結構。萃取后的神經束內所有的細胞包括許旺細胞、束膜細胞、成纖維細胞、血管的內皮細胞和平滑肌細胞均已消失，神經髓鞘和軸突被清除。本實驗結果顯示萃取神經的組織形態及組織抗原與萃取次數有密切關系，萃取2次較為理想。同時本實驗還證明了用化學萃取法清除人類外周神經中的細胞而保存纖維性支架是可行，采用該方法可制備長段粗大的人類去細胞神經。

參考文獻

［1］ Dumont CE , Hentz VR .Enhancement of axon growth by detengent-extracted nerve grafts .Transplantation ,1997 ,63:1210-1215.

［2］ Sondell M , Lundborg G ,Kanje M .Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction .Brain Res ,1998,795:44-54.

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