如何做好組織培養生產過程中污染防止工作

祁恒佐

摘要:組織培養的英文為mericlone,是meri(meristem=分裂組織)+ clone (營養繁殖系)的合成語。又稱植物克隆,指通過無菌操作把植物體的外植體接種于人工配制的培養基上。在人工控制的環境條件下進行離體培養。而污染是植物組織培養中的三大難題之一,普遍發生于不同的植物組織、器官中,控制污染是組培苗生產中的重要環節。文章就組織培養過程中的污染來源及防止作了些探討。

關鍵詞:組織培養;生產過程;污染來源

中圖分類號:Q943文獻標識碼:A

文章編號:1674-1145(2009)20-0102-02

隨著生物技術的發展,組培生產技術在我國農業生產中應用速度很快,我國組培工業化生產始于20世紀70年代,近年來這項技術的應用范圍十分廣泛,尤其在作物育種、苗木及花卉的脫毒和快繁等方面更具其他技術手段所無法比擬的優勢。雖然組織培養技術操作并不難,但對一些技術環節的要求卻十分嚴格,稍有疏忽便會延誤實驗進程,甚至導致整個試驗失敗,為此我們必須重視在組織培養生產過程中污染帶來的危害。以下就組織培養過程中的污染來源及防止作一些探討。

一、在組織培養生產過程中污染的來源

(一)外植體自身帶菌

許多植物都是栽培在室外,而空氣環境中有大量微生物存在,這些微生物可通過植物自然的孔口或傷口進入植物內部,也有一些兼性腐生菌,可由外植體或通過相應的侵入機制侵入植株內部,如果在接種操作前對這些認識不足,對外植體消毒不嚴,就很容易發生污染現象。

(二)培養基或接種工具滅菌不徹底

在對培養基滅菌過程中,如果滅菌時間過短、滅菌時溫度達不到要求、滅菌鍋壓力記數不準等因素都有可能導致培養基滅菌不徹底,使一些病原微生物殘留在培養基中,一旦接種后就會造成污染。使用滅菌不徹底的接種工具,滅過菌的接種工具存放時間過長,都會導致在生產中造成污染,所以生產中要做好培養基和接種工具的滅菌和消毒工作。

(三)接種室消毒不嚴

在組培生產過程中,除了植物本身外,大部分污染來源便是來自接種操作室。因為在接種操作室中,未過濾的空氣中含有大量的微生物,這些微生物可隨著操作人員或植株接觸時而發生污染,所以接種室消毒不嚴,也易引發污染發生。

(四)人員因素

在整個操作室內,人員是最大的帶菌者,其不管在毛發或是衣服等,都隱藏著數不清的微生物。這些微生物的存在都可能造成一定的危害。為此在進入操作室前,接種人員的工作服、鞋帽都必須進行消毒處理,進入接種室必須換上消毒過的鞋帽,接種前,接種人員必須認真洗手,還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手,這樣在一定程度上可減輕污染的危害。

(五)超凈工作臺上的濾網過濾不徹底

超凈工作臺使用過久,或保養不當,而造成濾網壞掉或灰塵過多,導致在接種操作時對空氣過濾不徹底,也易產生污染。

(六)栽培過程污染

在栽培室,組培瓶外和外界氣體交換時,亦會有一些微生物進入。污染幾率取決于空氣中帶菌密度與組培瓶空氣交換率。

二、防止污染的方法

(一)認真做好外植體的選擇和消毒工作,防止外植體帶菌

對外植體的選擇要考慮選擇的時間和部位,盡量選取帶菌少的材料,在時間上一般在植株的生長旺盛季節如春季和秋季病原微生物數量相對要少些,對于外植體的部位一般以幼嫩的部位較好。另外要做好外植體的消毒工作,目前外植體消毒常用藥劑有:70 %～75%的乙醇溶液,0.3%～0.6%的次氯酸鈉溶液和0.1%的升汞溶液,選用何種消毒劑和消毒時間要根據外植體的幼嫩程度和部位確定,一般要求既將外植體表面的微生物殺死,又要求盡可能少傷害外植體組織和表層細胞。在生產實踐中防止外植體污染,也可實行多次滅菌和交替滅菌相結合的辦法,最終達到消滅雜菌的目的。

(二)改善接種室和培養室的環境條件,保證接種與培養環境清潔無菌

與外植體自身帶菌所產生的污染相比,操作污染和環境污染是可以克服的。在組培生產中,真菌的污染一般與環境有關,細菌污染與接種材料及工具有關。生產中要通過定期做好對接種室與培養室消毒工作,減少環境中的微生物數量,減輕對污染的危害,為此,在接種前接種室要認真做好消毒工作,且超凈工作臺在接種前,認真擦洗,紫外燈要開20～30min左右。培養室的相對濕度應控制在70%左右,對每件物品放到超凈工作臺上,都要用75%酒精認真擦洗一遍,方可放到臺面上,只有這樣在一定程度上可控制污染程度。

(三)操作人員嚴格遵守無菌操作規程

接種人員在接種操作中,應嚴格遵守無菌操作規范要求。接種人員的工作服、口罩、帽子等布質品要定期進行濕熱滅菌,在超凈工作臺的操作區內,不要放入過多的待用物品,避免氣流被擋住產生污染。定期清洗或更換超凈工作臺過濾器,接種前15～20min打開風機,風速調整到20～30m/min,并對臺面用75%酒精噴霧消毒,工作人員進入操作室前必須對工作服、鞋帽進行消毒處理,進入接種室必須換上消毒過的鞋帽,接種前,接種人員必須認真洗手,還要用70%的乙醇棉球擦拭雙手,只有接種過程中嚴格遵守操作要規范,才可避免因人為(轉上頁)(接下頁)因素造成污染。

(四)培養基及接種工器具要嚴格滅菌,確保滅菌質量

在對培養基和接種工具滅菌時,要先檢查滅菌鍋的使用情況,發現問題要立即檢修。在滅菌過程中要絕對保證滅菌應達到的壓力、時間,確保滅菌質量。一般要求壓力應達到0.1個大氣壓,時間維持在15～20分鐘,并且壓力表降到零后不能馬上出鍋,防止外界環境的冷空氣倒吸入已滅菌的培養瓶內引起真菌污染,應待鍋內稍冷卻后再出鍋。對組培生產過程中培養容器封口采用塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等材料,在使用前要認真做好清冼和消毒工作,不符合要求堅決不用。在分裝培養基時,勿觸瓶口,防止培養基粘在瓶口上,引起污染,瓶口封好后要檢查封口是否破損,扎瓶口位置適當,松緊適宜。對已污染組培瓶要經高壓滅菌后再清洗。

(五)在培養基中加入適量的抗生素

這是目前較常用的方法,抗生素可以直接加入到培養基中,也可以用抗生素噴灑或浸泡外植體。但植物種類不同,所用抗生素的種類、濃度和處理時間也不同,因此必須對不同植物采用不同的抗生素的種類、濃度和處理時間進行實驗探討。一般情況下,為消除革藍氏陽性菌對有些木本植物污染莖段組培苗,可在培養基中加入四環素、頭孢等混合物,可使細菌完全被消除。另外用頭孢菌素Ⅱ消除某些觀賞植物外植體中的內生菌也有非常明顯的效果。

(六)利用病毒在植株體內分布不均勻的原理,生產脫毒苗

主要是針對在植物內部寄生的病毒,因病毒在生長點區域幾乎不存在,且病毒也難以長到頂芽的分生組織,所以切取頂芽的分生組織進行組織培養,通過組織培養技術就可培養成無病毒植株,而且脫毒效果好,后代遺傳性穩定,所以是目前生產無病毒苗最安全、最重要的一條途徑。

(七)利用培養基中高鹽或高糖的濃度,抑制微生物的生長

在培養基中有一些高鹽或高糖的濃度可抑制微生物生長,或單寧酸存在時也可以達到抑制微生物生長的效果。

(八)減少培養基中的某些有機成分,可抑制微生物的生長繁殖

培養基中有機物如VB1、VB6、煙酸等有機成分,是某些細菌生長的必需物質,除去這些有機物后,細菌無法生長發育,逐漸死亡減少。這樣也可在一定程度上減輕污染所帶來的危害。

總之,組培生產中污染的發生是不可忽視的環節,在生產過程中思想上要高度重視,行動上要有嚴格遵守操作規范,才能在一定程度上減輕污染所帶來的危害。