HPLC測定 7種龍膽科植物花中龍膽苦苷與獐牙菜苦苷的含量

張興旺,陶燕鐸,梅麗娟,邵 赟

(1.中國科學院西北高原生物研究所,青海西寧 810008;2.中國科學院研究生院,北京 100049)

龍膽花為藏醫常用品種,分為白花龍膽和雜花龍膽,在臨床上為多品種入藥,具有清濕熱、瀉肝膽實火、鎮咳、利喉、健胃功能,主治感冒發燒、目赤咽痛、肺熱咳嗽、胃熱、腦痧、尿道熱、陰癢及陰部濕疹、天花等[1]?！端{琉璃》云:“邦見按花色不同可分為白色、藍色和雜色三類?！?。龍膽花常作為藏成藥的君藥或臣藥,如龍膽花丸、十五味龍膽丸、三味龍膽丸等。龍膽科植物主要含有的裂環烯醚萜苷類化學成分龍膽苦苷、獐牙菜苷等,是龍膽科的苦味成分和活性成分[2]。本實驗首次建立了藏藥 7種龍膽花中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量測定的 HPLC方法,并對它們的含量進行了比較,為龍膽花多品種入藥提供科學的依據。

1 儀器與材料

微波實驗儀 (帶回流、磁力攪拌);Agilent 1200LC高效液相色譜儀,G1379A在線脫氣機,G1311A四元泵,G1329A標準型自動進樣器,G1316A柱溫箱,Agilent1200色譜工作站,AG204電子分析天平

麻花秦艽 (Gentiana straminea Maxim.)花、達烏里秦艽 (Gentiana dahuricaFisch.)花、黃管秦艽(Gentiana officinalisH.Smith)花、管花秦艽 (Gentiana siphonanthaMaxim.Ex Kusnez.)花、線性龍膽(Gentiana lawrenceiBurk.)、云霧龍膽 (Gentiana nubigenaEdgew.)花,藍玉簪龍膽 (Gentiana veitchiorum Hemsl.)花于 2009年 8月采自青海省境內,均為野生,海拔均在 3 500 m以上,由中國科學院西北高原生物研究所梅麗娟高級工程師鑒定。

甲醇、磷酸均為分析純,色譜用甲醇為色譜純。龍膽苦苷 (批號為:110770-200308)、購自中國藥品生物制品檢定所,純度大于 98%;獐牙菜苦苷由作者從麻花秦艽中分離得到,經歸一化法檢測,純度大于 98%。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Fusion-RP 80 Ac18柱 (150 mm×4.6 mm,5μm);柱溫:30℃;流動相:甲醇 -0.2%磷酸溶液梯度洗脫 (0～25 min:15%～30%);流速:1 mL/min;檢測波長 240 nm;進樣量:5μL。標準品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 對照品 (a)和樣品 (b)HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取獐牙菜苦苷,龍膽苦苷標準品適量,加甲醇制成 0.105 g·L-1,0.3 g·L-1的溶液 ,搖勻 ,0.45μm的微孔濾膜過濾后作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取龍膽花樣品約 0.5 g,精密稱定,置 250 mL平底燒瓶中,加入 20 mL甲醇,置微波實驗儀中,回流攪拌提取 20 min,冷卻至室溫,濾過,濾液收集到50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,0.45μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。

2.4 標準曲線及線性范圍

分別精密吸取對照品溶液 1,3,5,7,9μL,在上述色譜條件依次進樣,以進樣量 (X)為橫坐標,峰面積 (Y)為縱坐標繪制標準曲線,回歸方程見表1。

2.5 精密度試驗

精確吸取對照品溶液 10μL,按 2.1節色譜條件測定 5次,結果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的RSD分別為 1.21%,0.84%,表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取麻花秦艽花約 0.5 g,精密稱定,按 2.3節方法制備供試品溶液,分別在 0,2,4,6,8,12 h后在上述色譜條件下進樣 5μL,結果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的 RSD分別為 1.1%,1.54%,表明樣品溶液在 12 h內穩定。

2.7 重復性試驗

取麻花秦艽花約 0.5 g,精密稱定,按上述供試品溶液的制備方法和測定條件,重復測定 5份,結果獐牙菜苦苷,龍膽苦苷峰面積的 RSD分別為 1.3%,1.62%,表明重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知獐牙菜苦苷,龍膽苦苷含量的麻花秦艽花樣品 5份,每份約 0.5 g,精密稱定,加入對照品獐牙菜苦苷 1.002 mg,龍膽苦苷 4.012 mg,制備樣品溶液。精密吸取 5μL進樣分析,計算平均回收率,結果見表2。

表2 獐牙菜苦苷,龍膽苦苷加樣回收率

2.9 樣品含量測定

取供試品溶液,過 0.45μm的微孔濾膜,分別進樣 5μL,測定 (n=5),取 5次測定的平均值,結果見表3。

表3 7種龍膽花中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷測定結果

3 討 論

3.1 7種龍膽花中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷含量的比較

由表3可以看出,黃管秦艽花中獐牙菜苦苷的含量最高為 0.712%,云霧龍膽花含量最低為0.222%,其他龍膽花介于二者之間。管花秦艽中龍膽苦苷的含量最高為 3.21%,黃管秦艽中的含量最低為 1.60%,本實驗對這 7種龍膽花中 2種主要有效成分的含量進行了比較,可為龍膽花多品種入藥提供科學的依據。

3.2 不同提取方法的比較

比較了 3種提取法:甲醇加熱回流 30 min;甲醇微波回流 (帶磁力攪拌)20 min和甲醇超聲 30 min。結果表明:7種藥材微波提取率均大于加熱回流法和超聲法,而且與其他提取方法相比,微波輔助提取法具有提取時間短、溶劑消耗及廢物產生量低、提取選擇性和提取物的純度高等特點而被廣泛用于天然植物的提取中[3-7]。實驗過程中還比較了提取10 min、20 min、30 min對藥材提取率的影響 ,結果表明 20 min與 30 min提取率接近,因此,采用微波動態回流提取法提取 20 min對 7種龍膽花進行提取制樣。

3.3 檢測波長的確定

將獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對照品溶液在 200～400 nm范圍內進行掃描,結果在 240 nm處有較好吸收,故選擇 240 nm為檢測波長。

3.4 流動相的選擇

在篩選獐牙菜苦苷與龍膽苦苷兩種活性成分測定的色譜條件過程中,曾嘗試過用不同比例的甲醇-0.2%的磷酸作為流動相進行梯度洗脫,發現甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫 (0～25 min:15%～30%),流速:1 mL/min,7種龍膽花中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷的色譜峰與共存組分完全達到基線分離。

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