神經營養素-3修復脊髓損傷的研究進展

黨彥麗,李俊岑,楊拯,田蕓,張曉

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后脊髓的修復重建是一個研究難題。目前的研究表明,脊髓損傷后神經營養因子缺乏是導致脊髓損傷后功能恢復差的重要原因之一,神經營養素-3(neurotrophin-3,NT-3)是神經營養素家族的重要成員,具有廣泛的生理學作用。近年來眾多學者表明NT-3在神經損傷的修復方面起著重要的作用,對脊髓損傷的修復有很好的效果。

1 NT-3的結構和生物學作用

NT-3是由Ernfors等于1990年發現的繼神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)之后神經營養素家族的重要成員,它是一種小分子量的堿性蛋白質。成熟的NT-3由119個氨基酸殘基構成,有6個保守的半胱氨酸并形成3對二硫鍵,保守序列集中在半胱氨酸附近[1]。

NT-3的功能部位存在于周圍神經系統、中樞神經系統的不同部位與腸神經系統[2]。它的作用廣泛:①促進神經元的生長、發育、分化和成熟,對多種神經元具有神經保護和營養作用;②阻止胚胎期及出生后運動神經元細胞死亡,維持損傷脊髓神經元的存活,促使軸突延伸,提高神經細胞軸突再生的內在再生能力;③促進脊髓損傷后皮質脊髓束纖維、背柱感覺傳導纖維及背根節纖維的出芽和再生;④促進再生軸突的髓鞘化[3],減慢橫切損傷脊髓神經元死亡速度[4];⑤選擇性的加強脊髓神經元的存活和生長發育[5]。此外,外源性的N T-3可阻止皮層運動神經元、紅核、背核及脊髓感覺投射神經元軸突離斷后的凋亡,促進其存活。

2 NT-3多途徑修復SCI

2.1 基因移植 目前,在基因移植修復SCI方面,研究最廣泛的主要是NT-3與神經干細胞聯合移植和N T-3與骨髓間充質干細胞聯合移植修復脊髓損傷。

2.1.1 NT-3與神經干細胞聯合移植 神經干細胞(neural stem cells,NSCs)存在于成年哺乳動物的脊髓、海馬和室管膜下層。它具有自我復制和多向分化潛能[6],經多次分裂后仍能穩定地保持自身的特性。

單純移植NSCs能促進脊髓損傷后受損傷神經元的存活與神經纖維再生,但是單純移植NSCs引起的神經元存活與軸突再生是有限的。NT-3不僅能防止脊髓損傷后神經元的萎縮,促進受損傷的上行和下行軸突再生[7,8],還具有促進NSCs向神經元分化的作用[9]。NSCs移植到損傷后的脊髓中能夠存活并保持增殖活性,分化為神經元,從而替代死亡的宿主神經元,并可能與損傷處兩端的神經突起形成突觸聯系[10],以橋接的方式促進神經通路的重建。Himes等的研究表明,將編碼神經營養素-3的基因片段導入NSCs,使其在移植部位進行表達,改善局部微環境,可促進失突觸神經元的生存和增殖[11],進而促進損傷脊髓的功能恢復[12]。Blesch等應用NT-3基因修飾NSCs,移植入大鼠C3損傷SCI動物模型中,2周后發現相對于未修飾的NSCs移植組,NT-3基因修飾組可見高水平的神經生長因子(NGF)及腦源神經營養因子(BDNF)的分泌,以及大量感覺神經投射形成,并且60%分化為神經元,3%分化為膠質細胞[13]?？梢?NT-3基因修飾的NSCs移植不僅可替代因損傷而發生死亡的神經元,而且還可以分泌促進神經元存活及軸突再生的神經營養因子。

2.1.2 NT-3與骨髓間充質干細胞聯合移植 骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種骨髓中造血的結構性和功能性支持細胞,能分泌多種生長因子,對多種組織起支持作用。BMSCs能夠自我復制、自我更新,特性穩定,連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能[14]。目前認為骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷的機制可能為:①分泌多種神經營養因子,改善脊髓局部微環境并啟動再生相關基因的順序表達,從而促進軸突的再生。②使損傷的脫髓鞘軸索再髓鞘化。③橋接脊髓損傷斷端,形成功能性突觸,重新建立神經傳導通路[15]。將BMSCs直接植入到標準化的脊髓損傷模型中,可分化為具有神經元或膠質細胞特征的細胞[16],促進功能的恢復[17]。

Lauren等在定量分析BMSCs分泌的神經營養因子中,發現包括BDNF和NGF在內的許多神經營養因子,而未檢測到NT-3的表達[18]。為了將BMSCs和NT-3有效地結合起來運用到脊髓損傷的治療中,有實驗研究[19]根據BMSCs能很好地結合到中樞神經系統損傷部位的特點,把BMSCs作為一個理想的載體細胞,將神經營養因子靶向脊髓[20]。NT-3基因在脂質體的介導下轉染到體外培養的大鼠BMSCs中,從而使BMSCs攜帶NT-3基因,觀察靶細胞中NT-3基因的表達水平。研究表明,BMSCs可穩定、高效表達外源基因,并于轉染后的BMSCs中檢測到NT-3蛋白的表達。表達的NT-3可促進神經元的存活,誘導內源細胞增殖和促進神經纖維的再生[21]。軸突再生是神經修復的重要組成,移植BMSCs就像“橋梁”一樣為軸突的再生提供支架,或引導、趨化軸突向前生長,抑制膠質細胞、防止瘢痕修復,讓再生的神經元軸突順利通過損傷處,使損傷神經軸索再髓鞘化[22],為損傷脊髓的兩側殘端建立新的突觸聯系創造條件,重建神經通路[23]。NT-3與BMSCs聯合移植的成功為脊髓損傷的修復奠定了堅實的基礎。

2.2 載體介導 載體介導的基因治療,是在體外將目的基因導入適當的移植細胞后,篩選出能夠高效表達目的基因的移植細胞并移植到體內靶組織,通過提高局部NT-3的濃度,促進脊髓損傷的恢復。

2.2.1 病毒載體介導 病毒載體包括單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒(Adv)、腺相關病毒(AAV)和慢病毒(Lv)載體[24]。由于Adv載體可以攜帶多種神經營養因子基因并有效地轉染神經元和膠質細胞,所以應用較為廣泛[25]。將攜帶膠質源性的NT-3重組腺病毒轉入鼠脊髓橫斷損傷的后肢骨骼肌中,結果在腰段脊髓的運動神經元中發現攜帶膠質源性的NT-3表達,并保護運動神經元免于軸突斷裂誘發的細胞死亡[26]。在SCI的實驗動物模型中,將帶有NT-3基因的重組腺病毒微注射入周圍神經段中移植到脊髓半橫貫損傷處形成“再生橋”,可見有相當多的神經元重新長出皮質脊髓束到損傷處或損傷處遠端,有明顯的后肢功能恢復[27,28]。但是,病毒載體都有一個共同的缺陷在于會產生免疫反應或細胞毒性,甚至致癌[29]?？紤]到病毒載體的局限性,目前非病毒載體的研究倍受人們的關注。

2.2.2 非病毒載體介導 非病毒載體可以克服病毒載體的缺陷,具有低細胞毒性和低免疫反應等特性。Wu Jun[30]等利用NT-3基因非病毒載體轉染嗅鞘細胞,結果表明非病毒載體介導轉染細胞很安全,并且能夠高效能的表達NT-3,同時促進軸突向外生長來增強脊髓損傷修復。因此,非病毒載體可以廣泛地運用到臨床研究中,以彌補病毒載體的不足。

2.3 克隆 由于NT-3在組織中含量極微以及分布不均,要獲得大量NT-3通過組織提取還有一定的困難,并且很昂貴,因此采用克隆的方法為NT-3治療脊髓損傷帶來新的曙光。陳昌杰等從人腦基因組DNA獲取NT-3,并對其進行基因測序,然后運用基因工程的方法在體外克隆出大量的NT-3,導入損傷部位進行修復[31]。鄧興力等應用RT-PCR成功從大鼠腦組織中克隆出NT-3 cDNA,然后運用基因重組技術將其插入質粒載體構建真核表達質粒,植入損傷部位使其表達達到治療效果[32]。因此,通過克隆使NT-3廣泛地存在于損傷部位可以有效促進脊髓再生,從而加快功能的恢復。

2.4 直接注射 逆向運輸的神經營養因子缺乏是造成周圍神經損傷時運動神經元死亡的主要原因之一[33],而NT-3能夠減少神經元的死亡。由于此種疾病需要長期用藥,所以,能使脊髓前角神經元長期表達成為一種行之有效的辦法。李志全[34]等根據脊髓直接注射可以減輕神經根撕脫傷[35],將重組的NT-3直接注入損傷部位,使其在局部持續表達,通過影響超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的表達來達到保護神經元的目的[36]。研究表明此種方法對脊髓神經元的存活和再生具有雙重作用。

2.5 督脈電針治療 督脈電針治療能夠增高脊髓損傷處鄰近組織的N T-3水平,但其作用機制目前尚不清楚。有人推測,其機制可能是激活了宿主脊髓組織的神經膠質細胞和神經元的NT-3表達所致[37]。有研究用電針作用于脊髓部分背根切除術的大鼠,觀察到鄰近保留背根的背根節神經膠質細胞和神經元的N T-3 mRNA及其蛋白表達都有增加[38]。

3 展望

大量文獻已經表明NT-3對脊髓損傷修復的促進作用,因此,通過補充神經營養素-3來治療脊髓損傷成為一種行之有效的方法。不同的治療途徑往往會對神經元的存活和再生起到不同的效果,從而影響修復的效果?；蛑委熓且环N重要手段,在動物實驗中已取得好的效果,但由于安全性的問題還沒有進行脊髓損傷方面的臨床試驗。相信隨著研究的深入會有很好的臨床應用前景。

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