假單胞菌L-3對氧化樂果降解條件的優化

王立東, 阮長青, 郎雙靜

(1.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心,黑龍江大慶163319;2.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319)

氧化樂果是目前中國常用的大噸位農藥品種之一,雖然該農藥的使用為保證農作物的豐收起到了重要的作用,但其高毒、對農產品和環境存在較嚴重的污染等問題,越來越引起人們的重視[1]。微生物降解是消除有機磷農藥污染最主要的途徑,國外從20世紀50年代開始研究有機磷農藥的治理技術,確認微生物降解有機磷農藥具有費用省、環境影響少、可最大限度降低污染物濃度、可用于其他技術難以應用的場地等優點[2-3]。Wackett等[4]從土壤中分離出一株假單胞菌能降解除草劑阿特拉津,能以阿特拉津為惟一氮源,在90 min內使100 mg/L阿特拉津完全降解。楊惠芳等5]研究發現,添加降解菌可促進土壤中殺蟲劑單甲咪的降解。由此可見,用微生物控制農藥污染的生物修復技術顯示出廣闊的應用前景,但是由于農藥污染環境的化合物組成很不穩定,環境中溫度、p H值及通氣量等波動也較大,有可能抑制特定優勢微生物的生長。另外,投放到環境中去的特定微生物種群還會受到該環境土著微生物種群的影響,甚至受到拮抗而不能在該環境中成為優勢種群[6-8]。

作者通過對實驗室篩選出的菌株L-3對氧化樂果降解培養基及環境條件的優化,希望探尋更有利于菌體生長的條件,從而提高對氧化樂果的降解效果,為氧化樂果降解試驗的進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

GC-9900氣相色譜儀:上?？苿撋V儀器有限公司制造;NDP-9052型電熱恒溫培養箱、TGL-16B臺式離心機、722S型分光光度計:上海精密科學儀器有限公司生產;LRH-280型微電腦控制生化培養箱:廣東省醫療器械廠制造;SG2型p H計:梅特勒-托利多儀器上海有限公司生產。

1.2 培養基與試劑

普通培養基:牛肉膏 3.0 g,蛋白胨 10.0 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水 1 000 mL,p H 7.0。

基礎培養基:NaCl 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41.5 g,MgSO40.5 g,蒸餾水1 000 mL,p H 7.0。

分離培養基A:NH4NO30.5 g,Na2HPO41.19 g,KH2PO40.45 g,MgSO40.45 g,瓊脂 15 g,蒸餾水1 000 mL,p H 7.0,使用前加入500 mg/L氧化樂果溶液。

分離培養基B:NaNO32 g,KCl 0.5 g,MgSO40.5 g,MnSO40.10 g,BaCl20.05 g,CaCl20.05 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,p H 7.0,使用前加入500 mg/L氧化樂果溶液。

發酵培養基:蔗糖17 g,牛肉蛋白胨9.2 g,KH2PO41.84 g,KCl 1.0 g,MgSO40.50 g,MnSO40.10 g,BaCl20.05 g,CaCl20.05 g,蒸餾水 1 000 mL,p H 7.0,氧化樂果500 mg/L。

菌種:黑龍江八一農墾大學食品學院實驗室分離制得,鑒定為假單胞菌,命名為L-3。

農藥試劑:40%氧化樂果乳油,北京金宏大生化有限公司產品。

1.3 菌株活化的方法

接種菌株于普通培養基中,30℃下于160 r/min振蕩培養 12～18 h,備用[8]。

1.4 氣相色譜的檢測條件、方法及降解率的計算方法

1.4.1 檢測條件 GC-9900氣相色譜儀。條件:不銹鋼柱SE-30(4 mm×1 m)。柱溫180℃、氣化室225℃、檢測器溫度220℃;氮氣流量50 mL/min,氫氣流量60 mL/min,空氣流量46 mL/min;檢測器為FPD。

1.4.2 檢測方法 采用國標GB/T 14552-2003的方法進行測定。

1.4.3 降解率計算

1.5 試驗方法

1.5.1 碳源的選擇及其質量濃度對氧化樂果降解的影響 在含500 mg/L氧化樂果的分離培養基A中分別加入0.5 g/dL的不同碳源,并將制備好的菌懸液以3%的接種體積分數接入到培養液中,在p H 7.0、30 ℃、160 r/min振蕩培養3 d,用氣相色譜法測定降解前后氧化樂果的質量濃度,計算降解率,同時測定OD600值。

將優選出最適碳源以不同質量濃度添加到含500 mg/L氧化樂果的分離培養基A中,測定不同底物質量濃度條件下氧化樂果的降解率,選出最適碳源質量濃度。

1.5.2 氮源的選擇及質量濃度對氧化樂果降解的影響 以相同質量濃度的其它氮源代替含500 mg/L氧化樂果的分離培養基B中的NaNO3,并將制備好的菌懸液以3%的接種體積分數接入到培養液中 ,在 p H 7.0、30 ℃、160 r/min 振蕩培養 3 d,用氣相色譜法測定降解前后氧化樂果的體積分數,計算降解率,同時測定OD600值。

將優選出最適氮源以不同質量濃度添加到含500 mg/L氧化樂果的分離培養基B中,測定不同氮源質量濃度條件下氧化樂果的降解率,選出最適氮源質量濃度。

1.5.3 磷源的選擇及質量濃度對氧化樂果降解的影響 在含500 mg/L氧化樂果的分離培養基A和分離培養基B中加入一定的蔗糖,接種培養3 d后,測定不同培養基中氧化樂果的降解率,并過對培養基中成分進行分析。

將優選出磷源以不同質量濃度添加到含500 mg/L氧化樂果的分離培養基B中,測定不同磷源質量濃度條件下氧化樂果的降解率,選出最適磷源質量濃度。

1.5.4 二次回歸正交旋轉實驗確定降解培養基降解培養基中C、N、P最佳質量濃度的確定采用二次回歸正交旋轉組合設計,實驗因子的水平及編碼見表1[9]。數據統計分析:采用DPS軟件(3.01專業版)進行數據統計分析。

表1 實驗因素與水平Tab.1 Test facts and levels

1.5.5 不同環境條件對降解的影響

1)不同p H值對降解效率的影響:制備菌懸液,以3%的接種體積分數接種于優化的降解培養液中,調p H 值依次為 5、6、7、8、9、10,添加 500 mg/L氧化樂果,設不接菌的空白為對照,每處理重復3次,測定降解率。

2)不同溫度對降解效率的影響:制備菌懸液,以3%的接種體積分數接種于含500 mg/L氧化樂果的100 mL優化的降解培養液(p H 7.0)中,同時設不接菌的空白對照 ,分別于 15、20、25、30、35、40℃控溫搖床培養72 h,搖床轉速160 r/min,每處理重復3次,測定降解率。

3)不同接種接體積分數對降解效率的影響:制備菌懸液,分別以 1%、2%、3%、4%、5%的接種體積分數接種于含500 mg/L氧化樂果的100 mL優化的降解培養液(p H 7)中,30 ℃、160 r/min,搖床培養72 h,設不接菌的空白對照,每處理重復3次,測定降解率。

4)不同初始氧化樂果的質量濃度對菌株L-3降解效率的影響:制備菌懸液,分別接種于含50、100、200、400、800 mg/L 氧化樂果的 100 mL 優化的降解培養液中,30℃、160 r/min振蕩培養,每隔24 h測定氧化樂果的降解率,繪制生長曲線。

2 結果與討論

2.1 不同碳源對L-3菌落降解氧化樂果能力的影響

不同碳源對氧化樂果降解效率的影響見圖1。由圖1可以看出,添加的碳源中,蔗糖的降解率最高,降解率高達72.03%,添加葡萄糖、果糖、乳糖的培養液也能夠降解氧化樂果,但稍低于蔗糖,添加可溶性淀粉的培養液對氧化樂果的降解率很低,所以選擇蔗糖作為培養液的碳源;培養基中菌體的生長狀況與對氧化樂果降解情況一致,即在碳源為蔗糖時菌體的生長量也達到最大。

圖1 碳源對氧化樂果降解的影響Fig.1 Influence of different carbon source during degradation

2.2 蔗糖質量濃度對L-3菌降解氧化樂果的影響

不同的蔗糖質量濃度對氧化樂果降解效果的影響見圖2。

圖2 不同蔗糖質量濃度對氧化樂果降解的影響Fig.2 Effect of sucrose concentration on degradation rate

從圖2可以看出,在氧化樂果質量濃度一定的條件下,無蔗糖的存在,菌株不能降解氧化樂果,隨著蔗糖質量濃度的升高,菌株對氧化樂果的降解率明顯提高,菌株含量在1%～1.5%的范圍時,氧化樂果的降解率最高,隨著蔗糖質量濃度進一步升高,降解率反而下降。

2.3 不同氮源對L-3菌落降解氧化樂果能力的影響

不同的氮源對氧化樂果降解效率的影響見圖3。從圖3可以看出,有機氮比其它無機氮有利于菌體的生長,降解效果好。在有機氮中,牛肉蛋白胨的降解效果高于胰蛋白胨和酵母浸粉,為最適的氮源;培養基中菌體的生長狀況與對氧化樂果的降解情況一致,即在氮源為牛肉蛋白胨時菌體的生長量達到最大。

圖3 不同氮源對氧化樂果降解率的影響Fig.3 Influence of different nitrogen source during degradation

2.4 牛肉蛋白胨質量濃度對L-3菌降解氧化樂果的影響

不同的牛肉蛋白胨質量濃度對氧化樂果降解效果的影響見圖4。

圖4 不同牛肉蛋白胨質量濃度對氧化樂果降解率的影響Fig.4 Effect of different beef peptone concentration on degradation rate

從圖4可以看出,在未添加外加氮源時,菌株能夠降解氧化樂果,說明菌株能以氧化樂果為惟一氮源生長。當牛肉蛋白胨的質量濃度為0.5 g/dL時,降解效果最好,降解率高達76.32%,隨著牛肉蛋白胨質量濃度的增加,降解率有所下降。

2.5 KH2PO4質量濃度對L-3菌降解氧化樂果的影響

不同磷源培養基中氧化樂果的降解率見表2。通過表2可以看出,接種3 d后的分離培養基A中的氧化樂果的降解率為74.34%,分離培養基B中的降解率為45.67%,分離培養基A比分離培養基B高出相差28.67%。同時分離培養基B中不含磷元素,說明菌株能夠以氧化樂果為惟一磷源,磷鉬藍分光光度法檢測發酵液無磷酸生成。

表2 不同磷源培養基中氧化樂果的降解率Tab.2 Degradation rate of different phosphorus source medium

KH2PO4質量濃度對氧化樂果降解率的影響見圖5。由圖5可以看出,加入一定量的 KH2PO4對降解有促進作用,當 KH2PO4的質量濃度為0.1 g/dL時,降解效果最好,降解率高達78.58%,隨著KH2PO4質量濃度的增大,降解率有所下降。

圖5 KH2PO4質量濃度對氧化樂果降解率的影響Fig.5 Effect of KH2PO4concentration on degradation rate

2.6 二次正交實驗結果與分析

通過以上的單因素實驗研究了培養基的C,N,P組分對降解的影響,最佳C,N,P質量濃度為:蔗糖1.50 g/dL,牛肉蛋白胨 0.5 g/dL,KH2P040.1 g/dL。根據單因素最佳C,N,P含量確定因素的上下限,從而進一步通過二次正交實驗確定降解培養基的組成。各處理的降解率的測定結果見表3。

2.6.1 回歸方程的建立 為考察各因素對氧化樂果降解的影響,根據表3中試驗結果,以降解率為指標,對實驗結果進行分析,見表4,可得出三因素與降解率之間的回歸方程為:

表3 培養基中C、N、P含量對降解率的影響Tab.3 Effect of carbon、nitrogen and phosphorsources ondegradation rate

表4 回歸旋轉正交組合計算結果Tab.4 Calculating results of two revolving orthogonal experiment

2.6.2 回歸方程的顯著性檢驗 為了檢驗回歸方程的顯著性,計算各類偏差平方和,結果見表5。

表5 回歸旋轉正交組合方差分析Tab.5 Error analysis of two revolving orthogonal experiment

首先,用F1來檢驗回歸方程擬合情況,由表5可知,F1=3.60F0.05(9,13)=2.72,方程在α=0.05水平上顯著,說明在各個處理水平的結果之間存在差異,二次回歸方程與實際情況擬合的較好,可以作為實驗操作的數學模型,即可以通過計算降解率來表示氧化樂果的降解情況。

2.6.3 回歸方程系數的顯著性檢驗 由于是正交旋轉設計,可用各偏回歸平方和Q進行F檢驗或t檢驗,實驗中選擇t檢驗剔除回歸方程的不顯著項。經t檢驗可知,回歸方程中t1、t3不顯著,被剔除,其他回歸系數均在不同程度上顯著,因此回歸方程可寫為:

2.6.4 回歸方程的優化分析 方程局部最優點是最佳的實驗水平,利用求偏導數的方法求解最優水平,對回歸方程求一階偏導,并當到達局部最優點時,導數為零,此計算點為駐點,可能為回歸方程的極值,再計算回歸方程在其定義域內各端點的函數值進行比較,則其中的最大值為回歸方程的最優值。求偏導解方程組得到:x1=0.717,x2=0.812,x3=0.718,計算駐點f(0.717,0.812,0.718)及回歸方程在其定義域內各端點值發現,其中端點f(1.682,-1.682,1.682)為最大值,將編碼值換算成實際值時,按Zj=Z0j+xjΔj進行計算,確定優化條件。

即當蔗糖為1.7 g/dL,牛肉蛋白胨為0.92 g/dL,KH2PO4為0.184 g/dL,菌株降解氧化樂果的能力最強,此時培養基組成為優化的降解培養基組成。

最適培養基降解效果驗證試驗:在優化培養基中,菌種培養3 d氧化樂果的降解率為82.59%,測定結果均高于三元二次旋轉正交設計實施的23次實驗。

2.6.5 各因素重要性分析 對于由實驗數據所建立的二次回歸方程,可利用對二次方程系數的檢驗結果,來判斷因素對氧化樂果降解率的影響,即求出方程各因素對指標的貢獻率大小。

利用貢獻率判斷因素主次,對二次方程按如下公式求得回歸系數方差比F(j)、F(jj)、F(ij)。

由以上計算可知:Δ1>Δ2>Δ3,所以對于氧化樂果降解的過程中,得到各個不同因素的影響效果順序為:碳源>氮源>磷源。

2.7 不同環境條件對氧化樂果降解的影響

2.7.1 p H值對降解效率的影響 不同p H條件下菌株L-3對氧化樂果的降解效果見圖6。

圖6 L-3在不同pH值條件下對氧化樂果的降解效果Fig.6 Degradations of omethoate by isolate L-3 under different culture pH

由圖6可以看出,在p H 5～10范圍內,氧化樂果都能降解,以p H 7效果最好。在較強的堿性條件下(p H 9～10),氧化樂果有一部分自然降解,可知氧化樂果在弱酸和中性的條件下生長穩定。

2.7.2 溫度對降解效率的影響 不同溫度條件下菌株L-3對氧化樂果的降解效果見圖7。

圖7 培養溫度對菌株降解效果的影響Fig.7 Degradations of omethoate by isolate L-3 under different culture temperature

由圖7可以看出,在15～25 ℃范圍內,氧化樂果的降解率偏低,說明低溫條件不利于氧化樂果的降解;在25～40℃范圍內,氧化樂果的降解效果較好,30℃時降解率最高。L-3菌株降解氧化樂果的最適溫度與其最適生長溫度是一致的。在較高的溫度條件下35～40℃氧化樂果有一部分自然降解。

2.7.3 不同接菌種體積分數對降解效率的影響不同接菌體積分數條件下菌株L-3對氧化樂果的降解效果見圖8。

圖8 接種體積分數對氧化樂果降解效果的影響Fig.8 Degradation of omethoate by isolate L-3 with different inocula quantities

由圖8可以得出,隨著接種體積分數的增加,菌株L-3對氧化樂果的降解率呈先升后降的趨勢,當菌體接種體積分數為3%時,氧化樂果的降解率最高,達80.16%。

2.7.4 菌株L-3對不同初始質量濃度氧化樂果的降解 菌株L-3對不同初始氧化樂果濃度的降解效果見圖9。

圖9 不同初始質量濃度氧化樂果對降解率的影響Fig.9 Effect of different omethoate concentration on degradation rate

從圖9可以看出,經過5 d的培養,降解率為72.58%～77.71%。50 mg/L的氧化樂果降解速度相對較快,3 d后降解基本穩定,最終降解率為72.58%;其它幾種質量濃度氧化樂果的降解趨勢基本相似,5 d后降解趨于穩定。

3 結 語

作者對從農藥生產廠污泥中篩選出能夠高效降解氧化樂果的假單胞菌L-3的降解條件進行優化,并對環境條件對氧化樂果降解效果的的影響進行了研究,得出菌株L-3最適的降解條件:碳源為蔗糖、氮源為牛肉蛋白胨、磷源為 KH2PO4;二次正交回歸設計得出最佳的降解條件為蔗糖質量濃度為1.7 g/dL、牛肉蛋白胨質量濃度為0.92 g/dL、KH2PO4質量濃度為0.184 g/dL,在優化的培養基中對氧化樂果進行降解,其降解率高達82.59%;最適的環境條件為p H 7～8,溫度30℃,接種體積分數3%,初始氧化樂果質量濃度為50 mg/L;優化后氧化樂果的降解率高達82.59%。

[1]仲維科,郝戩,孫梅心,等.我國食品的農藥污染問題[J].農藥,2000,39(7):1-3.ZHONG Wei-ke,HAO Ji,SUN Min-xin,et al.Pestides residues in food in China[J].Pesticides,2000,39(7):1-3.(in Chinese)

[2]Donna Chaw,Ulrica Stoklas.Composting of cattle manure and hydrocarbon contaminated flare pit soil[J].Compost Science and Utilization,2001,9(4):322-335.

[3]Harruta S,Cui Z,Huang Z.Construction of a stable microbial community with high cellulose-degradation ability[J].Applied Microbiol Biotechnology,2002,59:529-534.

[4]Wackett,Prenafeta-Bold F X,Opsteeg J L,et al.Biodegradation of azo hyes in coculture of anaerobic granular sludge with aerobic aromatic amine degrading enrichment culture[J].Appl Microbil Biotechnol,1999,51:865-871.

[5]王保軍,劉志培,楊慧芳.甲單咪農藥的微生物降解代謝研究[J].環境科學學報,1998,18(3):298-302.WANGBao-jun,LIU Zhi-pei,YANG Hui-fang.Microbiological deterioration metabolism of jdm pesticide[J].Environmental Science Journal,1998,18(3):298-302.(in Chinese)

[6]Kauatner M,Mahro B.Microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils affected by the orgnic matix of compost[J].Appl Microbil Biotechnol,1996,44:668-675.

[7]Filippi C,Bedini S,Levi-Minzi R,et al.Cocomposting of olive oil mill by-productis:chemcial and mocrodiological evaluations[J].Compost Science and Utilization,2002,10(1):63-71.

[8]Fang M,Wong M H,Wong J W C.Digestion activity of thermophilic bacterial isolated from ash-amended sewage sludge compost[J].Water,Air and Soil Pollution,2001,126:8-12.