線粒體在卵母細胞成熟和早期胚胎發育中的作用

戴蜜蜜，葛紅山，呂杰強

（溫州醫學院附屬第二醫院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

卵母細胞發育、成熟是一個從量變到質變的復雜過程，需經過細胞質成熟和細胞核成熟才具備受精和進一步發育的能力。作為細胞質中含量最豐富的細胞器和細胞的“供能中心”，線粒體在卵子成熟及其后胚胎發育的過程中發揮了極其重要的作用。伴隨卵泡發育進程，卵子線粒體發生了許多特征性的變化，影響和左右著卵子成熟及其后的胚胎發育。隨著胚胎學和輔助生殖技術的發展，線粒體與卵母細胞成熟及早期胚胎發育之間的關系引起了廣泛關注，現將相關研究進展綜述如下。

1 線粒體與線粒體基因組

線粒體一般呈粒狀或桿狀，但因生物種類和生理狀態而異，可呈環形、線狀、分叉狀或其他形狀，其在卵子成熟的過程中形態亦有所變化。電鏡下線粒體由內外兩層膜封閉，包括外膜、內膜、膜間隙和基質四個功能區。內膜向線粒體基質褶入形成嵴，嵴上有基粒?；|為內膜和嵴包圍的空間，參與三羧酸循環的酶類均位于基質中，基質中還含有纖維絲和電子密度很大的致密顆粒狀物質，內含 Ca2+、Mg2+、Zn2+等離子。

人類線粒體基因組DNA（mtDNA）是一個16569bp的雙鏈閉合環狀分子，編碼22種tRNA，2種rRNA和13種蛋白質，這13種蛋白質都是呼吸鏈酶復合物的成分，與核DNA編碼生成的多肽一起參與氧化磷酸化。mtDNA可以獨立于核DNA之外進行復制、轉錄和翻譯[1]。與核DNA不同，mtDNA缺乏組蛋白的保護和必要的修復機制，且處于高自由基的環境中，因而突變率遠較核DNA高[2]。

線粒體是母系遺傳的細胞器，人類受精卵中的線粒體幾乎全部來自卵細胞。線粒體從母親傳遞到子代數量銳減，這就是所謂的“遺傳瓶頸效應”，可導致新基因型的快速分離并影響生殖能力[2]。

2 卵母細胞中mtDNA的拷貝數

與體細胞不同，卵母細胞線粒體DNA呈單拷貝狀，mtDNA拷貝數可以反映卵母細胞線粒體的數量[3]。卵母細胞的mtDNA拷貝數高度可變，在人類尤為明顯，人卵母細胞mtDNA拷貝數變化范圍為20000～598000，平均193000。mtDNA在卵母細胞生長、成熟過程中不斷復制，從最初不足10個至卵子成熟后20000～500000個[4]。卵母細胞成熟后（MII期）mtDNA復制停止，直至囊胚期才恢復，因此在受精前貯備充足數量的線粒體對卵子受精和早期胚胎發育至關重要。而外源補充（體外注入）大量新鮮、高活力的線粒體可以提高卵子受精和胚胎種植率[5]。

許多研究表明：mtDNA 拷貝數與卵母細胞的受精和早期胚胎發育潛能有著重要關聯。Santos等[3]研究顯示正常受精的人卵母細胞內mtDNA平均拷貝數為250454±29730，受精失敗的卵母細胞內mtDNA平均拷貝數為163698±20192，提示mtDNA含量可反映卵母細胞的質量和受精結局。另外，卵巢功能的好壞對mtDNA的拷貝數亦有影響，May-Panloup等[6]研究表明卵巢功能不全的卵母細胞mtDNA拷貝數平均只有100000±99000，遠低于卵巢功能正常組卵母細胞的mtDNA拷貝數（317000±184000），提示卵巢功能不全的卵母細胞發育潛能低下可能與其mtDNA拷貝數低下有關。卵母細胞mtDNA拷貝數亦會隨年齡的增長而退化，高齡婦女卵母細胞發育潛能差可能是由于卵母細胞中mtDNA拷貝數下降，或者mtDNA轉錄水平下降所致[7]。

3 線粒體在卵母細胞成熟過程中的分布情況

線粒體在卵母細胞中的分布具有階段性，卵母細胞成熟前后線粒體分布發生了明顯的變化。劉姍等[8]研究顯示人卵母細胞體外成熟前后，線粒體分布由未成熟卵母細胞中以周邊分布為主變為成熟卵母細胞中以均勻分布為主。對小鼠卵子的研究還發現卵母細胞成熟過程中，線粒體的核周聚集是細胞質成熟的一部分，缺乏線粒體核周聚集導致了卵子成熟阻滯[9]。

卵母細胞成熟過程中，不同階段線粒體分布不同，因此線粒體的分布是評價卵子和早期胚胎發育潛能的重要參數[10]。缺乏線粒體在胞質中的重新分布往往標志著細胞質未成熟，這與卵子發育潛能低密切相關。線粒體準確的分布為微管活動提供了能量保證，有助于減數分裂過程中染色體的正常分離，否則可能導致減數分裂異常，引起非整倍體的增加[11]。

4 線粒體膜電位與卵母細胞成熟、早期胚胎發育

線粒體膜電位是細胞活性的關鍵指標之一，它反映了電子傳遞和氧化磷酸化過程中質子的轉運。線粒體的許多功能，包括蛋白質運輸、ATP產生和脂質生成，都依賴膜電位的維持[12]。正常情況下，線粒體高極化狀態（膜電位較高），有助于線粒體產生ATP。發育潛能好的卵子線粒體膜電位比發育潛能差的膜電位高[10]。

線粒體膜電位的高低影響氧化代謝水平，若線粒體內膜受到損害引起膜電位降低，導致氧化代謝水平下降，不能產生足夠的ATP，可對卵子成熟、受精和胚胎發育結果產生影響。因此，早期胚胎發育阻滯可能與成熟卵母細胞內線粒體活性低下有關。膜電位還與鈣離子動態平衡的調控有關。Van Blerkom等[13]認為，MII期卵高極化線粒體和滑面內質網均位于胞質周邊，可能參與游離鈣離子的局部調節。Jones等[14]比較新鮮收集的人MII期卵與冷凍保存的人MII期卵后發現，凍存人MII期卵細胞質周邊線粒體極化喪失，低溫冷凍會損傷MII期卵線粒體活性，解凍后的卵子釋放游離鈣離子進入細胞內的能力減弱。

異常線粒體低膜電位可導致卵母細胞減數分裂異常，引起植入前胚胎鑲嵌紊亂[15]。研究發現，高極化和低極化線粒體的比率可反映卵母細胞內異常的線粒體分布和胚胎的代謝缺陷，并影響卵子體內、體外受精能力[16]。線粒體高低極化的比率亦與IVF后胚胎卵裂的碎片率有關[17]。

新近研究表明[18]，卵丘細胞產生的NO可作為調節因子調節線粒體膜電位的高低，主要為抑制作用，卵泡內的低氧環境能加強這種抑制作用。NO和O2的比例高低是否會影響卵胞漿內線粒體的極性還有待于進一步研究。

5 mtDNA突變對卵母細胞成熟及胚胎發育的影響

線粒體是極其敏感的細胞器，卵母細胞成熟過程中體內外環境的變化均可影響mtDNA復制的準確性。mtDNA缺乏組蛋白的保護和必要的自我修復能力，且處于高自由基的環境中，因此極易發生結構突變。另外因mtDNA的基因排列得非常緊湊（幾乎不含內含子），任何突變都可能累及基因組的重要功能區，產生嚴重的后果。突變所產生的效應取決于該細胞中野生型和突變型線粒體DNA的比例，只有突變型DNA達到一定數量（閾值）才足以引起細胞的功能障礙，這種現象稱為“閾值效應”。mtDNA突變類型多達150多種，包括缺失、插入、重復等，最常見的是mtDNA 4977 bp缺失（也稱普通缺失）。mtDNA 4977 bp缺失與卵子衰老、低受精能力、發育阻滯及死亡有關[19]。人卵母細胞mtDNA 4977 bp缺失頻率為32.8%，胚胎為8%。在未受精的卵母細胞中mtDNA 4977 bp缺失率顯著增加，可達70%以上，高齡及某些不孕婦女比例更高[6]。mtDNA 4977 bp缺失的累積可導致ATPase6、ATPase8、細胞色素氧化酶III和NADH-CoQ等氧化還原酶類基因缺失，從而引起線粒體功能障礙和ATP產生受損，且會干擾卵子成熟、受精及胚胎發育[20]。Gibson等[21]檢測獼猴MII卵發現其mtDNA缺失主要是5740 bp缺失，且這種缺失與獼猴年齡及體外受精結局有相關性。

Lorraine等[22]利用高效液相色譜技術分析26個人卵母細胞，發現8個卵母細胞存在14種點突變，都是A-G突變或T-C突變。這些突變的分布呈現隨機性，并表現出不同水平的異質性（<5%～50%）。他們猜測，這些突變可能在卵母細胞發育早期發生，可增加兒童期氧化磷酸化酶系疾病的風險。mtDNA點突變累積呈現年齡依賴性，一種T414G突變在26～36歲病人的卵子中發生率為4.4%，而在37～42歲病人的卵子中發生率為39.5%，兩者差異有顯著性。這種突變存在于mtDNA調控區，可能在卵子成熟及其后胚胎發育的過程中影響mtDNA的轉錄和復制。

外源激素刺激也可造成卵子mtDNA 4977 bp缺失率增加，未受外源激素刺激的卵母細胞4977 bp缺失率為21.3%，而接受刺激作用的卵母細胞4977 bp缺失率達71.4%。另外，未受外源激素刺激的卵母細胞與成熟卵母細胞、胚胎以及受精失敗的卵子相比，4977 bp缺失率差異存在顯著性[21]。

6 線粒體產生ATP為卵母細胞成熟提供能量來源

ATP為卵母細胞成熟、受精、胚胎發育等提供能量保證，線粒體的氧化磷酸化過程是產生ATP的主要方式。卵子發生時線粒體復制和ATP累積對遠期發育成熟至關重要[10]。所以，ATP含量可以作為卵母細胞成熟和發育潛能的標志之一，未成熟卵的ATP含量明顯低于成熟卵，ATP含量低的未成熟卵，其成熟后受精率也低。

卵子紡錘體的形成需要正常的線粒體功能，減數分裂中期，線粒體為紡錘體形成、染色體分離提供能量，如果線粒體功能異常造成ATP產生不足，就可能影響紡錘體結構，導致非整倍體的發生[23]。氧化應激時線粒體損傷，產生ATP不足，導致紡錘體形態損傷[8]。

使用外源促性腺激素能改變卵子線粒體的能量生產。Lee等[24]的研究顯示，注射15 IU hCG或15 IU hCG和15 IU PMSG的金色倉鼠的卵子ATP水平顯著高于對照組。過量促性腺激素則可能使ATP產生過量或使抑制ATP產生的底物缺乏，造成ATP產生達到有害水平，進而影響卵母細胞的發育能力。

來自卵母細胞線粒體移植的研究證實，將年輕婦女的卵母細胞線粒體移植入老齡婦女的卵子胞漿，后者的ATP含量會明顯升高，并改善了其卵母細胞及胚胎發育能力[25]。

7 展望

探索IVF/ET過程中卵子和胚胎高損失率的機制是當前和今后人類ART和胚胎學研究的焦點之一。隨著對線粒體研究的深入，線粒體含量、空間分布、mtDNA拷貝數、膜電位及其產生的ATP對卵母細胞成熟及早期胚胎發育的影響逐漸為人們所了解。鑒于線粒體在卵子發育成熟及早期胚胎發育過程中的變化和作用，我們有理由相信線粒體與ART周期中卵子/胚胎的高損失率間存在著某些重要關聯，因此開展更多更廣泛的相關研究，以進一步了解線粒體在生殖過程中的作用，具有重要的研究和臨床意義。

[1] Scarpulla RC.Nuclear control of respiratory gene expression in mammalian cells [J].J Cell Biochem,2006,97(4):673-683.

[2] Lynsey M Cree1, David C Samuelsa,de Souse lopes SC, et al.A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explainsthe rapid segregation of genotypes [J].Nature Genetics,2008,40(2):249-254.

[3] Santos TA, El Shourbagy S, St John JC.Mitochondrial content reflects oocyte variability and fertilization outcome[J]. Fertil Steril,2006,85(3):584-591.

[4] Jansen RP, Burton GJ. Mitochondrial dysfunction in reproduction [J]. Mitochondrion,2004,4(5-6):577-600.

[5] Shoubridge EA, Wai T. Mitochondrial DNA and the mammalian oocyte [J]. Curr Top Dev Biol,2007,77:87-111.

[6] May-Panloup P, Chretien MF, Jacques C, et al.Low oocyte mitochondrial DNA content in ovarian insufficiency [J].Hum Reprod,2005,20(3):593-597.

[7] Hsieh RH, Au HK, Yeh TS, et al. Decreased expression of mitochondrial genes in human unfertilized oocytes and arrested embryos [J]. Fertil Steril,2004,81(Suppl 1):912-918.

[8] 劉姍,李媛,高選,等.人卵母細胞體外成熟前后線粒體分布的變化[J].解剖學報,2007,38(5):593-596.

[9] Nagai S, Mabuchi T, Hirata S, et al. Correlation of abnormal mitochondrial distribution in mouse oocyte with reduced developmental competence[J]. Tohoku J Exp Med, 2006,210(2):137-144.

[10] Tarazona AM,Rodriguez JI,Restrepo LF,et al. Mitochondrial activity,distribution and segregation in bovine oocytes and in embryos produced in vitro [J].Reprod Domest Anim,2006,41(1):5-11.

[11] Katayana M,Zhong Z,Lai L,et al.Mitochondrial distribution and microtubule organization in fertilized and cloned porcine embryos:implications for developmental potential [J].Dev Biol,2006,299(1):206-220.

[12] Wang LY,Wang DH,Zou XY,et al. Mitochondrialfunctions on oocytes and preimplantation embyros[J]. J Zhejiang Unvi Sci B,2009,10(7):483-492.

[13] Van Blerkom J.Mitochondria as regulatory forces in oocytes,preimplantation embryos and sten cell.[J].Reprod Biomed Online,2008,16(4):553-569.

[14] Jones A,Van BlerkomJ, Davis P, et al. Cryopreservation of metaphase II human ooocytes affects mitochondrial inner membrane potential:implications for developmental competence[J]. Hum Reprod,2004,19(8):1861-1866.

[15] Zhang X, Wu XQ,Lu S,et al. Deficit of mitochondria-derived ATP during oxidative stress impairs mouse MII oocyte spindles [J]. Cell Research,2006,16(10):841-850.

[16] Van Blerkom J, Davis P. Mitochondrial signaling and fertilization[J]. Mol Hum Reprod, 2007,13(11):759-770.

[17] Acton B, Jurisicova A, Jurisica I, et al. Alterations in mitochondrial membrane potential during preimplantation stages of mouse and human development[J]. Mol Hum Reprod,2004,10(1):23-32.

[18] Van Blerkom J, Davis P,Thalhammerv,et al. Regulation of mitochondrial polarity in mouse and human oocytes:the influence of cumulus derived nitric oxide [J]. Mol Hum Reprod,2008,14(8):431-444.

[19] Chan CC, Liu VW, Lau EY, et al. Mitochondrial DNA content and 4977 bp deletion in unfertilized oocytes [J]. Mol Hum Reprod,2005,11(12):843-846.

[20] Hsieh RH,Au HK,Yeh TS,et al.Decreased expression of mitochondrial genes in human unfertilized cocytes and arrested embryos[J].Fertil Stetil,2004,81(Suppl 1):912-918.

[21] Gibson TC, Kubisch HM, Brenner CA. Mitochondrial DNAdeletions in rhesus macaque oocytes and embryos[J].Mol Hum Reprod,2005,11(11):785-789.

[22] Jacobs L, Gerards M,Chinnery P,et al. mtDNA point mutations are present at various levels of heteroplasmy in human oocytes[J]. Mol Hum Reprod,2007,13(3):149-154.

[23] Takumi T, Neri QV,Katagiri Y,et al. Effect of treating induced mitochondrial damage on embryonic development and epigenesis [J].Biol of reprod,2005,72(3):584-592.

[24] Lee ST, Oh SJ, Lee EJ, et al.Adenosine triphosphate synthesis,mitochondrial number and activity, and pyruvate uptake in oocytes after gonadotropin injections [J]. Fertil Steril,2006,86 (Suppl 4):1164-1169.

[25] Thouas GA,Trounson AO,Jones GM,et al. Effect of female age on mouse oocyte developmental competence following mitochondrial Injury [J]. Biol of reprod,2005,73(2):366-373.