線粒體DNA拷貝數的研究新進展

張素素(綜述)，孫 嘉(審校)

(1.南方醫科大學第二臨床醫學院臨床醫學系，廣州 510282； 2.南方醫科大學珠江醫院內分泌科，廣州 510282)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是唯一存在于細胞器中且相對獨立的基因組，可控制和編碼部分蛋白質，其在基因組中的個數稱為mtDNA拷貝數。近年來，mtDNA拷貝數是腫瘤領域的研究熱點之一。mtDNA拷貝數的變化可能在腫瘤及多種疾病的發生、發展過程中發揮至關重要的作用。與核基因組相比,mtDNA缺乏有效的損傷修復系統，更易受環境、遺傳等因素影響，造成復制、轉錄水平及拷貝數發生變化，但其變化的具體機制尚不明確，對mtDNA拷貝數進行研究是不斷深入了解線粒體的重要途徑之一。

1 mtDNA拷貝數的定義

mtDNA拷貝數是mtDNA在線粒體基因組中的個數，每個線粒體含有2～10個mtDNA拷貝數。正常人每個體細胞mtDNA拷貝數為103～104，在不同類型的組織中具有一定特異性，每個外周血單個核細胞、肌細胞、神經元中分別為223～854、1075～2794、1200～10 800[1]。

2 mtDNA拷貝數的調控

有學者認為，可能存在一個較低的mtDNA拷貝數閾值，mtDNA拷貝數低于該值會觸發激活mtDNA復制，以提高mtDNA拷貝數；而當mtDNA拷貝數升高超過另一閾值時，會激活mtDNA的降解機制，降低mtDNA拷貝數[2]。目前存在幾種mtDNA拷貝數調控模式假說：ATP的需要量決定mtDNA的含量，但目前并無證據支持這一說法；核苷酸的利用率決定mtDNA的復制；mtDNA拷貝數受到多個復制起源的調控；線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)通過影響mtDNA復制改變其拷貝數[2]。

2.1TFAM與mtDNA拷貝數 TFAM是第一個被確定的mtDNA轉錄因子，由核染色體10q21編碼,含2個高遷移率蛋白結構域。人類細胞中約10 bp的mtDNA對應1分子TFAM蛋白，每個mtDNA約結合1000個TFAM分子[3]。根據鏈置換模型，哺乳動物mtDNA復制與轉錄偶聯在一起，TFAM介導mtDNA含量增加的可能機制有兩種：TFAM較高頻率地結合于輕鏈啟動子，提升轉錄介導的復制啟始；TFAM結合全基因組，可能通過降低DNA的更新速率以穩定mtDNA的穩態水平[4]。亦有學者認為，上述兩種機制并非相互排斥，主張一種通過調節TFAM活動的多元模式控制mtDNA拷貝數的變化；除了調節轉錄起始，TFAM大量且非特異地結合線粒體基因組，形成DNA環，引起超螺旋化，散在分布的點狀蛋白-DNA結構形成類核[4]。類核是線粒體基因組的功能單位，保證mtDNA免受多種損害。研究發現，TFAM結合mtDNA，可對抗人β淀粉樣蛋白1-42對人神經母細胞瘤細胞氧化呼吸鏈的損傷，其機制可能是TFAM過表達可維護線粒體類核結構及調節mtDNA拷貝數，從而改變細胞生存能力，降低細胞凋亡率[5]，可見TFAM可能與通過類核結構保護mtDNA免受氧化損傷有關，從而調控mtDNA拷貝數。

2.2同源重組修復蛋白Rad51與mtDNA拷貝數 同源重組修復蛋白Rad51是真核細胞染色體同源重組的重要催化劑，主要存在于線粒體內膜基質，參與mtDNA水平的維護。Sage等[6]發現，Rad51重組酶以及Rad51c和Xrcc3旁系同源蛋白的協同作用可調節脊椎動物受損染色體DNA的復制叉進程，三者減少會導致mtDNA拷貝數減少。無復制抑制因素存在時，Rad51缺乏可導致mtDNA拷貝數整體下降45%～50%，提示mtDNA的成功復制需要Rad51[7]?？梢?，Rad51對mtDNA拷貝數的調控作用可能是當復制叉遭遇損傷停滯時，參與完成mtDNA的準確復制。

2.3DNA聚合酶γ與mtDNA拷貝數 DNA聚合酶γ(polymerase γ，polγ)是目前已知唯一存在于線粒體內的線粒體特異性DNA聚合酶，由一個polγ催化亞基(polγA)和兩個附屬亞基(polγB)組成，分別由不同的核基因編碼。polγ在mtDNA的復制和維護中必不可少，polγA的病理突變以mtDNA的缺失或消耗為特征。polγA對mtDNA的調控在一定程度上受核DNA甲基化的影響。老鼠出生后的干細胞中，核DNA甲基化與polγA的表達呈一定負相關性。編碼polγA的核基因CpG島上外顯子2高度甲基化，影響該CpG島下游的延伸及polγA的前體mRNA選擇性剪切和激活，抑制mRNA表達水平，從而影響mtDNA復制[8]。此外，基因啟動子區域的CpG島處于非甲基化狀態，發生甲基化時可導致基因沉默。這在一定程度上可以解釋DNA甲基化水平高，polγ表達水平和mtDNA拷貝數低的現象。

3 氧化應激對mtDNA拷貝數的影響

mtDNA沒有組蛋白保護，缺乏抗氧化機制和有效修復系統，且接近線粒體內膜電子傳遞鏈，極易受周圍活性氧類(reactive oxygen species,ROS)的損傷。當ROS超過內源性抗氧化防御系統的消除能力時，氧化/抗氧化失衡，會導致氧化應激的出現。在氧化應激作用下，mtDNA拷貝數可能升高或降低。妊娠糖尿病患者胎盤mtDNA拷貝數與氧化應激水平呈正相關，而在心力衰竭患者心肌組織中則呈負相關[9-10]。氧化應激在受影響的細胞中可能扮演兩種角色：一方面，輕度氧化應激損傷線粒體氧化呼吸鏈，可刺激線粒體及mtDNA分子的增加以代償減弱的線粒體呼吸功能，保證細胞的存活、損傷修復及所需蛋白質的合成；另一方面，氧化應激導致ROS的增加和氧化損傷的進一步加劇，超過某一閾值時，導致線粒體功能障礙甚至細胞死亡[11]。mtDNA的D-環區是mtDNA中兩段主要非編碼區之一，調控mtDNA的復制和轉錄，其對氧化應激敏感，易引起基因突變，影響mtDNA的復制和轉錄而導致mtDNA拷貝數下降[12]。氧化應激還可通過TFAM影響mtDNA拷貝數的變化，肝外膽汁淤積患者體內肝臟氧化/抗氧化失衡，隨氧化應激水平升高，TFAM及mtDNA拷貝數均呈下降趨勢[13]。Sage等[6]發現，氧化應激條件下TFAM優先結合氧化損傷的mtDNA，且結合率上升?？梢?，氧化應激條件下TFAM有保護mtDNA的作用[13]。

4 機體不同疾病狀態下mtDNA拷貝數的變化

4.1mtDNA拷貝數與骨質疏松 Kim等[14]發現，絕經后婦女外周血mtDNA拷貝數減少與股骨頸骨密度降低有統計學意義，但與椎體骨密度無關聯性，其原因可能是基因在椎體受影響較小或生物力學對椎體與股骨頸骨密度變化影響不一致。絕經后婦女雌激素水平顯著下降，抗氧化能力減弱，補充雌激素可降低氧化應激水平并增強抗氧化作用[15]。但Kim等[14]的研究未檢查受試者外周血氧化應激水平，故對于氧化應激是否是連接mtDNA拷貝數與BMD變化的中間紐帶有待進一步研究。

4.2mtDNA拷貝數與糖尿病及其并發癥 mtDNA拷貝數與糖尿病患者體內的脂肪氧化速率、胰島素敏感性及胰島素分泌呈正相關[16]。糖尿病視網膜病變大鼠病程初期，線粒體損傷防御機制活躍，TFAM、D-環區mtDNA-TFAM復合物、polγ及mtDNA拷貝數升高；隨著病程進展，mtDNA修復和復制機制不堪重負開始崩解；病程6個月時線粒體DNA功能受損，TFAM、mtDNA-TFAM復合物減少，mtDNA拷貝數下降。且糖尿病高糖血癥容易引起氧化應激，早期通過刺激polγ、TFAM等促進mtDNA拷貝數增加，以代償線粒體功能障礙。隨著氧化應激加劇，代償機制崩潰，polγ、TFAM減少，mtDNA拷貝數隨之下降[17]。

4.3mtDNA拷貝數與心血管疾病 心臟在體內具有最高的攝氧率，心力衰竭患者心肌組織氧化應激水平升高，過氧化物還原酶3過表達，使用線粒體抗氧化劑或TFAM增加可以改善mtDNA拷貝數減少的現象，從而改善心力衰竭的病理生理進程[10]。3～4個月齡心臟功能正常的小鼠，隨mtDNA拷貝數下降和氧化應激水平增加可發生嚴重異常情況[18]?？梢?，mtDNA拷貝數下降可能是預測心肌病的發生、發展的因素之一。提高mtDNA拷貝數能減緩循環壓力超負荷小鼠模型左心室心肌纖維化進程，可成為治療高血壓性心臟病的新途徑[19]。

4.4mtDNA拷貝數與腫瘤 線粒體對許多致癌因素敏感，mtDNA拷貝數的變化與多種腫瘤的發生、發展具有相關性。外周血mtDNA拷貝數減少可導致線粒體氧化磷酸化產生ATP減少的同時伴糖酵解的增強，增加肝細胞癌、進展期胃癌、腎細胞癌等風險，低mtDNA拷貝數者腎細胞癌患病率比對照組高1.56倍[1,20]。在肺癌、胰腺癌等腫瘤中，mtDNA拷貝數增高；而大腸癌與mtDNA拷貝數過低或過高均有關，呈U形曲線關系[21]。mtDNA拷貝數與某些腫瘤分化程度成反比，過去認為乳腺癌患者mtDNA拷貝數減少；Xia等[22]發現Ⅰ期乳腺癌患者mtDNA拷貝數呈低水平，而Ⅱ～Ⅳ期患者則增高。這可能與mtDNA受ROS不斷攻擊，復制增強以及代償能量需求有關。一項最新研究顯示，患者乳腺癌確診前3年的外周血mtDNA拷貝數下降，提示亞臨床乳腺癌也會影響mtDNA拷貝數的變化[23]。故mtDNA拷貝數變化可能是腫瘤發生過程中的一個早期事件。

5 結 語

關于mtDNA拷貝數的研究越來越多，涉及的范圍愈加廣泛，隨著科學研究的不斷發展，越來越多疾病被發現與mtDNA拷貝數的變化具有相關性，mtDNA拷貝數變化受環境、遺傳等因素影響，其中氧化應激作用是重要因素之一，不同因素對mtDNA拷貝數具體調控機制有待更多的研究去闡明。如何根據mtDNA拷貝數的變化對疾病的發生、發展做出預測及恰當治療，也將是今后研究的重要方向。

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