核仁素對LPS誘導的白細胞介素1β釋放的影響*

張 彬， 肖獻忠， 張文輝， 蔣 磊， 蔣碧梅△

(中南大學湘雅醫學院1病理生理學系，2組織學與胚胎學系，湖南 長沙 410078)

革蘭氏陰性細菌胞壁上的LPS(lipopolysaccharide，LPS)即內毒素，是引起膿毒癥(sepsis)的主要原因之一。當機體遭遇革蘭氏陰性細菌感染時，LPS釋放入血，與血漿中的LPS結合蛋白(LPS binding protein，LBP)形成復合物，由LBP運送至單核－巨噬細胞及多形核白細胞膜表面的白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)受體，然后通過跨膜信號受體 Toll樣受體 4(Toll like recept 4，TLR4)等將LPS信號轉入細胞，激活細胞內多條信號轉導通路，從而啟動炎癥介質的表達如白細胞介素1β(interleukin－1β，IL －1β)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor－ α，TNF － α)［1］。核仁素(nucleolin，由C23基因編碼)是一種具有多種生物學功能的RNA結合蛋白，在核仁的發生、核糖體的生物合成與成熟、細胞增殖與生長及細胞凋亡等過程中發揮重要調控作用［2，3］。近來研究發現革蘭氏陰性菌感染人THP－1單核細胞時伴有核仁素表達上調;LPS誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞活化時伴有核仁素裂解片段的表達下調［4，5］。這些證據表明，核仁素可能在炎癥反應中發揮重要作用。但是發揮何種作用以及如何起作用，目前仍不清楚。因此，本研究首先以內毒素血癥小鼠和內毒素刺激的巨噬細胞為模型，探討核仁素在炎癥中的表達，并采用基因轉染、反義寡核苷酸技術從正反兩方面深入探討核仁素對LPS所致細胞炎癥因子分泌的影響，從而為進一步探討核仁素在炎癥反應中的作用奠定基礎。

材料和方法

1 材料

BALB/c小鼠由本校實驗動物中心提供。正常RAW264.7細胞 (小鼠巨噬細胞)，貼壁生長，由本校細胞中心提供。pcDNA3.1－C23真核表達載體由本科室王海云碩士構建。鼠抗核仁素單克隆抗體購于Santa Cruz;GAPDH小鼠單克隆抗體購于中國康成公司;鼠IL－1β ELISA試劑盒購于Boster;Lipofectamine脂質體轉染試劑購自Invitrogen;大腸桿菌LPS(E.coli O111∶B4)購自 Sigma。

2 方法

2.1 細胞株傳代培養 RAW264.7細胞(小鼠巨噬細胞)用含10%新生小牛血清的DMEM培養基培養。將細胞放置于37℃、5%CO2的條件下培養，待細胞生長至約85% 的融合狀態用于實驗。

2.2 C23反義寡核苷酸的設計 從GenBank獲得小鼠C23基因全長cDNA，GenBank號為BC005460，選擇跨越起始密碼子的6－9位點作為靶位點，由堿基互補原則設計并合成正義(S)、反義(AS)及隨機(R)寡核苷酸。S:5'－CATGGTGAAGCTCGCAAAGGCTGGC－3';AS:5'－GCCAGCCTTTGCGAGCTTCACCATG－3';R:5'－CTACGAGACTGCCTCCACTGCTTCG－3';并將所有堿基進行硫代修飾。

2.3 pcDNA3.1－C23或C23反義寡核苷酸瞬時轉染RAW264.7細胞 根據Invitrogen公司提供的轉染操作說明書進行。具體步驟如下:以合適的細胞密度接種到6孔培養板上(接種密度是3×108cells/L)，待細胞達到80%－85%的融合狀態用于后續實驗。將20 μg pcDNA3.1 －C23 DNA 或20 μg C23 反義寡核苷酸稀釋于480 μL無血清培養基中，室溫下置5 min。將15 μL脂質體稀釋于485 μL的無血清培養基中，室溫下置5 min。然后將兩者混合，室溫下置20 min。將6孔板中的細胞用無血清培養基沖洗細胞2遍后，加入2 mL無血清培養基。將上述混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻。在37℃、5%CO2中培養6 h。6 h后，更換含有血清的全培養基，在37℃、5%CO2中培養24 h。

2.4 免疫印跡法(Western blotting) 按實驗室常規方法進行。用2×SDS裂解緩沖液裂解細胞，收集細胞總蛋白質，100℃煮沸10 min，12000 r/min離心10 min，收集上清。采用Bradford法進行蛋白定量，制備好的蛋白樣品置－80℃冰箱保存備用。30 g蛋白經10% －12%SDS－PAGE電泳6 h后，電轉(4℃，過夜)至硝酸纖維素膜，2%BSA室溫封閉3 h，先后加入靶蛋白抗體及HRP標記的相應IgG，室溫分別孵育1 h和0.5 h，DAB顯色試劑盒進行顯色。

2.5 酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 用LPS處理轉染pcDNA3.1－C23表達載體或C23反義寡核苷酸的細胞，在相應時點收集細胞培養基，按試劑盒說明操作，檢測IL－1β量的變化。

3 統計學處理

結 果

1 BALB/c小鼠內毒素血癥模型中核仁素表達的變化

小鼠內毒素血癥模型按照本實驗室的成熟方法建立。BALB/c小鼠經腹腔注射LPS(15 mg/kg)，分別于6 h、12 h、24 h提取肺組織總蛋白，用 Western blotting檢測不同時點核仁素的表達改變。結果顯示(圖1):與對照組相比，LPS注射6 h后110 kD核仁素全長分子表達上調，12 h達到最高并維持到24 h;80 kD的核仁素片段則于注射LPS 6 h后表達下調，持續至24 h。

2 核仁素在RAW264.7細胞炎癥模型中的表達改變

用500 μg/L LPS處理 RAW264.7 細胞，分別于6 h、12 h、24 h、36 h 收集細胞，提取細胞總蛋白，通過Western blotting分析不同時點核仁素的表達改變。結果發現(圖2):與未處理組比較，110 kD核仁素全長分子在LPS處理6 h后表達上調，12 h上調最明顯并維持到36 h;而80 kD的核仁素片段在LPS處理后逐漸減少。

Figure 1.Western blotting showed the level of 110 kD nucleolin was increased and the level of 80 kD nucleolin was decreased in the lung tissues of the mice treated with 15mg/kg of LPS at different time..n=3.*P＜0.05 vs control group.圖1 Western blotting檢測小鼠內毒素血癥不同時點肺組織中核仁素的表達

Figure 2.Western blotting showed the level of 110 kD nucleolin was increased and the level of 80 kD nucleolin was decreased in RAW264.7 cells treated with 500 μg/L LPS at different time..n=3.*P＜0.05 vs control group.圖2 Western blotting檢測LPS刺激下不同時點RAW264.7細胞中核仁素的表達

3 用生物信息學方法篩選可能受核仁素調控的炎癥介質基因

采用生物信息學方法分析，發現TNF－α、IL－1α、IL－1β等多個炎癥介質基因的mRNA分子中含有完整的核仁素結合元件，見表1，表明上述多個基因mRNA穩定性可能直接受核仁素調控。

表1 mRNA中含有核仁素結合元件的炎癥介質基因Table 1.Inflammatory mediator genes containing nucleolinbinding element

4 轉核仁素真核表達載體后RAW264.7細胞中核仁素的表達改變

用全長核仁素真核表達載體(pcDNA3.1－C23)瞬時轉染RAW264.7細胞24 h，收集細胞，提取細胞總蛋白，經Western blotting檢測核仁素的表達改變。結果顯示(圖3):與轉空載體組比較，轉全長核仁素真核表達載體組細胞中110 kD核仁素表達明顯上調。

Figure 3.Western blotting showed the level of 110 kD nucleolin was increased in RAW264.7 cells transfected with pcDNA3.1－C23..n=3.*P＜0.05 vs pcDNA3.1 group.圖3 Western blotting檢測核仁素基因轉染后RAW264.7細胞中核仁素的表達

5 核仁素過表達對LPS所致RAW264.7細胞IL－1β釋放的影響

用核仁素真核表達載體(pcDNA3.1－C23)瞬時轉染RAW264.7細胞24 h，經LPS處理后，分別于6 h、12 h、24 h收集上清，采用 ELISA 檢測 IL－1β 的變化。結果顯示:核仁素過表達對LPS所致IL－1β釋放有促進作用，見圖4。

Figure 4.ELISA showed nucleolin－overexpression promoted LPS－ induced IL －1β release in RAW264.7 cells..n=5.*P＜0.05 vs pcDNA3.1 group.圖4 ELISA顯示核仁素過表達對LPS所致RAW264.7細胞IL－1β釋放的影響

6 核仁素反義寡核苷酸對RAW264.7細胞中核仁素的表達改變

用核仁素反義寡核苷酸瞬時轉染RAW264.7細胞24 h，收集細胞，提取細胞總蛋白，經Western blotting檢測核仁素的表達改變。結果顯示(圖5):與正常組比較，轉脂質體或隨機寡核苷酸組的核仁素變化不明顯，而轉核仁素反義寡核苷酸組的110 kD核仁素表達明顯受到抑制。

7 核仁素低表達對LPS所致RAW264.7細胞IL－1β釋放的影響

用核仁素反義寡核苷酸瞬時轉染RAW264.7細胞24 h，于LPS 處理后的6 h、12 h、24 h 收集上清，采用ELISA檢測IL－1β的變化。結果顯示:LPS處理后IL－1β釋放明顯增加;但核仁素低表達抑制了LPS所致的IL－1β釋放，見圖6。

討 論

Figure 5.Western blotting showed the level of 110 kD nucleolin was decreased in RAW264.7 cells transfected with antisense oligonucleotide of nucleolin..n=3.*P＜0.05 vs control group.Lip:lipofectamine;R:random oligonucleotide;AS:antisense oligonucleotide.圖5 Western blotting檢測核仁素反義寡核苷酸轉染對RAW264.7細胞中核仁素表達的影響

Figure 6.ELISA showed nucleolin－deficiency suppressed LPS－induced IL－1β release in RAW264.7..n=5.*P ＜0.05 vs control group.ScrODNs:scramble oligonucleotides;AsODNs:antisense oligonucleotides.圖6 ELISA分析核仁素低表達對LPS所致RAW264.7細胞IL－1β釋放的影響

LPS通過激活多條信號通路促進體內炎癥介質的過表達，在膿毒癥發病中起著重要的作用。最近研究表明核仁素可能在炎癥中起作用。故本實驗擬從整體和細胞水平初步探討核仁素在LPS所致炎癥反應中的作用。研究發現LPS處理后，小鼠肺組織以及RAW264.7細胞中核仁素110 kD片段表達上調，而80 kD片段在LPS處理后逐漸減少。這結果提示，LPS所致小鼠內毒素血癥模型及細胞炎癥模型中伴有核仁素的表達改變。但核仁素的表達改變在LPS所致炎癥模型中是伴隨現象還是起了重要作用，仍需要進一步研究。

核仁素是一種RNA結合蛋白，能與含－(T/G)CCCG(A/G)－序列的 rRNA特異性結合［6］。近年發現核仁素還可作為反式作用因子與多個基因的mRNA分子中的－(T/G)CCCG(A/G)–序列的順式作用元件相結合來調控mRNA的穩定性，從而調控基因的蛋白質表達水平。Zhang等［7］發現核仁素可與生長抑制和DNA損傷誘導基因45α(growth arrest and DNA damage inducible gene 45α，GADD45α)mRNA結合來調控 GADD45α mRNA的穩定性。Chen等［8］發現核仁素可與IL－2 mRNA 的5＇－非翻譯區(5＇－untranslated region，5＇－UTR)相結合，增加其穩定性，使 IL－2蛋白表達增高;Singh等［9］發現核仁素可通過RNA/蛋白質相互作用，增加CD154 mRNA的穩定性。這些研究結果提示，核仁素可與炎癥介質基因的mRNA結合，從而調控其穩定性及表達。

通過生物信息學分析，發現 IL－1β、IL－1α、TNF－α等多個炎癥介質基因的mRNA分子中含有完整的核仁素結合元件(表1)。表明核仁素有可能通過與這些炎癥介質基因的mRNA結合而調控它們的表達，進而對炎癥反應起調控作用。IL－1β是LPS所致炎癥反應中的重要早期促炎介質，在炎癥反應中發揮重要作用。為了探討核仁素是否對IL－1β起調控作用，我們采用了核仁素真核表達載體及反義寡核苷酸，發現RAW264.7細胞中核仁素過表達后可促進LPS所致IL－1β的釋放，低表達則抑制LPS所致IL－1β的釋放。上述結果提示，RAW264.7細胞中核仁素的表達水平對LPS所致IL－1β的釋放有明顯的影響。但該影響是否通過核仁素與IL－1β mRNA結合，使IL－1 βmRNA穩定性增加而導致IL－1β表達增多，進而釋放增多，則仍需進一步的研究闡明。

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