核酸適配子在生物醫學領域中的應用

侯,魏 磊,吳 軍,侯 巍,孫 非*

(1.吉林大學再生醫學科學研究所,吉林 長春 130021;2.空軍航空大學門診部,吉林 長春 130022;3.解放軍208醫院461臨床部,吉林 長春 130021)

核酸適配子在生物醫學領域中的應用

(1.吉林大學再生醫學科學研究所,吉林 長春 130021;2.空軍航空大學門診部,吉林 長春 130022;3.解放軍208醫院461臨床部,吉林 長春 130021)

*通訊作者

1990年Tuerk[1]和Ellingto[2]報道了一種在體外應用隨機單鏈寡核苷酸文庫篩選、擴增特定配體的技術,此種技術可以得到能與非核酸靶分子具有高親和力、高特異性結合的寡核苷酸序列,此技術稱為指數富集配基的系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),篩選出的寡核苷酸序列稱為核酸適配子(aptamer)。由于核酸適配子與抗體類似,與靶物質結合的特異性和親和力可甚至優于抗體,加上其靶分子廣、穩定性強、易改造修飾等特點,可在基礎研究、臨床診斷、藥物研發等方面得以廣泛應用[3]而受到關注。本文對核酸適配子目前在生物醫學領域中的應用作一綜述。

1 SELEX技術原理與特點

1.1 SELEX技術的原理[1]

SELEX技術篩選核酸適配子的過程主要有以下幾個步驟:①預先設計并合成寡核苷酸文庫(DNA文庫或RNA文庫)。文庫中的寡核苷酸的兩端是固定序列(可依此設計PCR擴增的引物),中間隨機排列約25-30個寡核苷酸,所以文庫的總量可達l014-15;②文庫的篩選。將靶分子與文庫進行混合孵育,使其能與靶物質特異性結合,形成靶物質-寡核苷酸復合物,后可采取濾膜法、磁珠法、毛細管電泳法或柱層析等不同的分離方法,將與靶分子結合的寡核苷酸從文庫中分離出來。靶分子的混合物,通過PCR擴增后,再進行重復篩選。一般篩選8-20輪左右,最后將篩選到的核酸適配子文庫進行克隆、測序并鑒定所篩選的核酸適配子與靶分子結合的特異性和親和力。也可通過后續實驗驗證所得適配子與靶分子結合的最短序列。

1.2 核酸適配子的特點

1.2.1 應用范圍廣 寡核苷酸隨機庫的每個核苷酸種類都存在4種可能性(A、C、G或T),若隨機區有n個核苷酸,隨機序列有4n種可能性。30個左右的核苷酸文庫的容量能達到l014-15。單鏈寡核苷酸的一個獨特表現是容易形成各種形狀的二級結構和三級結構,空間結構的多樣性幾乎可以與所有種類的分子發生作用。適配子可以通過氫鍵、范德華力等與靶分子相互作用而形成穩定的復合物,有研究表明,適配子與靶分子的結合是相互誘導的適應性識別,當靶目標存在時,單鏈DNA或RNA發生適應性折疊與靶分子相互識別[4]。目前,SELEX技術所篩選的靶分子廣泛,可包括蛋白質、多糖、金屬離子、核酸、酶、完整的細胞、病毒顆粒、病原菌等。因此,與其他文庫篩選技術相比,SEIEX技術適應范圍更加廣泛。

圖1 SELEX技術篩選核酸適配子的基本原理

1.2.2 高特異性和親和力:核酸適配子只識別與其互補的分子空間結構,能夠分辨出靶分子結構上的細微差別。與靶分子的結合解離常數(kd)可達nmol/L甚至pmol/L水平,比抗體或其他類型配基有更高的親和力和特異性,幾乎可以完全避免非特異性結合[5]。如茶堿與其他黃嘌呤類似物咖啡因、可可堿的結構非常相似,常規的茶堿單抗與后兩者有交叉反應,而核酸適配子只特異結合茶堿,與其他兩種物質無反應,且與茶堿的親和力比與咖啡因高10 000倍。

1.2.3 制備簡單、產品穩定 核酸適配子與抗體相比,分子量小(5-25 ku),制備簡單、產生不依賴于動物、低成本、易重復、毒性低、免疫原性低、即使針對有毒物質也可篩選出其相應的適配子[6]。雖然適配子易被體內的核酸酶所降解,但各種核酸修飾方法可使適配子在體內的半壽期大大延長,穩定性增加;另外,適配子與聚乙二醇(PEG)等大分子物質結合可大大增加它的生物利用度。這些均為適配子作為治療試劑打下了基礎[7]。

適配子與單克隆抗體或者其他小分子藥物的作用機理更為相似。核酸適配子的特性使它們在作為治療藥物和診斷試劑某些方面甚至超越抗體[8-9]。

2 核酸適配子在疾病治療中的應用

2.1 抗凝血作用

由于核酸適配子的作用方式是直接結合并抑制已經存在的蛋白的活性,并且具有相對的安全性,價格適中等優點,正成為一種新型抗凝藥物。

凝血酶是凝血系統的重要調節因子,它可使纖維蛋白原轉變為纖維蛋白,產生凝血作用。核酸適配子ARC183是Archemix公司研制的已經進入臨床實驗的凝血酶抑制劑,可作為冠狀動脈旁路移植過程中的抗凝藥物[10]。它是一個長15nt的DNA分子,與凝血酶結合的解離常數(Kd)為2 nmol/L,與凝血酶原的Kd為50 nmol/L。ARC183在體外有很強的抗凝作用,可以抑制纖維蛋白原在凝血酶作用下的激活以及凝血酶引起的血小板聚集,與肝素相比,它可以降低肝素誘導的血小板減少癥的發生率,有效抑制凝血酶。在狗和猴的心肺分流術動物模型中,給予0.5 mg/kg.min-1的劑量,其活化凝血時間(activated clotting time,ACT)為1 500 S。它在體內只有約100 S的半壽期,可快速逆轉其抗凝作用,未見明顯的毒性作用和過度出血,顯示了臨床應用安全性。

適配子的短半壽期對抗凝血適配子是個有利的方面,而對于其它適配子的應用來說,如何防止被核酸酶降解是提高在體內作用穩定性的重要方面。已有多種修飾方法來修飾核酸適配子,其中較常見的是2′-氟和2′-氨基的修飾。例如:特異針對凝血因子IXa的適配子進行了2′-氟嘧啶修飾,同時在5‘端連接膽固醇分子,使得適配子在血循環中的時間從10 min提高到1-1.5 h。在單次注射劑量為0.5 mg/kg時可使其抗凝血作用時間大于1h[11]。如何對適配子的這種長時間抗凝作用進行清除,Rusconi等[12]巧妙設計了此適配子的“解毒劑”。他們合成了17nt的針對適配子序列的反義寡核苷酸,它可通過雜交作用來抑制適配子的功能。在動物模型中注入10 min后,此反義核酸就可中和適配子的95%的抗凝作用。

2.2 抗病毒

特異針對病毒外膜蛋白、整合酶、逆轉錄酶等的適配子均可用于抗病毒治療。人類免疫缺陷病毒(HIV)包膜糖蛋白由一個外部糖蛋白(gp120)和跨膜域(gp41)組成,并在病毒進入到細胞中的重要作用。

Jiehua等[13-14]成功的篩選出具有雙重功能的一系列抑制gp120核酸適配子,具有比抗體更好的阻止病毒復制的作用。

丙型肝炎病毒非結構區(HCV NS3)蛋白是治療HCV的一個重要靶標。Fukuda K等[15]以HCV NS3h為靶分子,從體外合成的81bp隨機單鏈DNA文庫中篩選得到與HCV NS3h特異結合的寡核苷酸適配子,適配子在體外對HCV NS3h的活性具有一定的抑制作用。Fukuda等[16]提純了針對NS3的RNA適配子,試驗表明該適配子能夠抑制NS3的90%的蛋白水解酶活性,而且在體內能夠抑制麥芽糖結合蛋白-NS3(MBP-NS3)70%的蛋白水解酶活性。最近,Jeon等[17]篩選出了能封閉流感病毒受體結合域而抑制流感病毒感染的DNA適體。

2.3 抗增殖作用

血管生成在腫瘤侵襲、轉移過程中發揮作用。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth fac.tor,VEGF)是血管生成的重要調節因子,在大多數實體瘤和某些病理情況下升高。針對VEGF165的具有核酸酶抗性的RNA適配子可以有效阻止VEGF與人臍帶血管內皮細胞結合和VEGF誘導的細胞增生?？筕EGF165的適配子可抑制人神經母細胞瘤細胞株神經生長因子的生長。濕性老年黃斑變性是老年人失明的主要原因。VEGF165 RNA適配子可局部應用治療濕性老年黃斑變性,臨床試驗效果較滿意[18]。

轉錄因子E2F是調節細胞增殖的主要因子之一。Mann[19]將E2F適配子用于抑制靜脈搭橋術后血管內皮增生的設想。通過還原壓力介導轉染法將E2f適配子轉入將移植的靜脈,結果12個月后,應用E2F適配子治療組的移植血管的閉塞率,狹窄率明顯較對照組低。

Farokhzad等[20]用攜帶多烯紫杉醇(docetaxe1)的海綿狀納米顆粒,其中含有輔聚物PLGA-b-PEG和對PSMA胞外部分特異的RNA適配子A10。體外實驗中,此復合物可特異結合于前列腺癌LNCaP細胞表面表達的PSMA蛋白,顯著增加其細胞毒性。單次瘤內注射,可使5/7的LNCaP細胞移植的裸鼠模型中的腫瘤全部消退,而且在109天內100%存活,對照組存活57%。此研究為將核酸適配子轉移進入細胞以及疾病的靶向治療提供了新的方法。

李真真[21]等建立SELEX技術篩選胃癌細胞SGC-7901適配子的方法,并初步鑒定獲得的SGC-7901細胞適配子。他們在體外合成全長88bp中間含52bp隨機序列的ssDNA文庫,通過優化PCR擴增條件,利用地高辛一抗地高辛抗體一堿性磷酸酶系統測定親和力,經SELEX反復篩選獲得胃癌SGC一7901細胞的特異性適配子。成功建立了SELEX技術體外篩選胃癌細胞SGC-7901高親和性適配子的方法。

3 核酸適配子在診斷中的應用

核酸適配子與靶物質結合所呈現的高特異性和敏感性,使其在臨床診斷中具有廣泛的應用前景,應用適配子檢測靶蛋白的研究不斷增多,基于適配子的檢測新技術也不斷出現。

3.1 生物傳感器

生物傳感器是依賴于分子識別元件的作用來構建的。通常,生物傳感器的識別元件主要是抗體、酶、受體和核酸等。目前已有大量的各類型生物傳感器應用在實際工作中。但是這些傳感器均具有一定的局限性,如單抗或多抗的制備比較繁瑣、固定時活性易損失、活性保存時間有限、使用時對環境和樣品條件要求比較高。然而,通過SELEX技術篩選得到的寡核苷酸適配子具備類似抗體一樣的對靶分子高的親和力和特異性,但相比大分子的抗體,寡核苷酸適配子分子量小,結構簡單,能保證合成的精確性及易連接其它分子進行修飾,如熒光素、生物素等。同時,寡核苷酸適配子可以變性、復性且速度快,可反復使用、長期保存?；诠押塑账徇m配子的這些優點,將適配子作為生物傳感器的識別元件,制成適配子生物傳感器(Aptasensors),具有不可替代的優勢。

3.1.1 適配子電化學生物傳感器:Ikebukuro等[22]研制出一種電流型電化學傳感器,利用兩種作用于凝血酶不同靶位的核酸適配子對凝血酶不同表位,一種用作捕捉分子,另一種用作檢測分子,以“三明治”夾心方式構建化學生物傳感器,成功地建立起凝血酶的檢測新方法。該傳感器平臺最低可檢測出10 nmol/L的凝血酶,線性范圍40-100 nmol/L。

3.1.2 適配子壓電生物傳感器:壓電生物傳感器是利用晶體的壓電效應原理的一類生物傳感器,Liss等[23]將IgE特異性單鏈DNA適配子固定在石英晶體金膜表面建立了適配子壓電石英生物傳感器模型,能在蛋白混合物中特異性檢測IgE,最低可檢測出0.5 nmol/L。實驗結果表明,適配子分子小,易于在金膜表面密集固定,比傳統的免疫傳感器敏感度高10倍,提高了壓電石英生物傳感器的檢測范圍,而且固定在金膜表面的適配子可耐受反復洗脫,不影響其靈敏度,有利于芯片的重復利用。

Yuan等[23]利用等離子體表面共振成像與適配子技術建立蛋白質芯片,檢測該蛋白質芯片上吸附的蛋白抗體凝血酶、血管內皮生長因子(VEGF)復合物。

3.2 適配子與分子信標:分子信標(molecular beacon)是近年發展起來基于熒光共振能量轉移現象的檢測技術。Li等[24]建立的適配子分子信標(molecular aptamer beacon,MAB)技術,用于凝血酶檢測,該方法可對反應過程進行實時檢測。Fang等[25]將針對血小板來源生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)B鏈的適配子兩端分別連接熒光基團和熒光淬滅基團,可以在體液或細胞培養液中檢測到pmol/L濃度的PDGF。最近研究人員將不同熒光淬滅分子對應用到PDGF檢測中,取得了較好結果,為應用適配子分子信標技術同時檢測多種靶分子打下了良好的基礎[26]。

3.3 生物質譜

近年來,適配子又被用于MALDI—MS(基質輔助激光解吸電離質譜)法中作為蛋白質捕獲和分析的工具[27]。將一個與凝血酶特異結合的DNA適配子共價結合到硅化玻璃面后,可以直接用來檢測凝血酶。在和不能形成G-四聚體的亂序寡核苷酸進行對照結合實驗后,發現只有特定的適配子可以捕獲凝血酶。將5-50 pmol的凝血酶分別與適配子共孵育,結果表明最佳的檢測范圍為5-10 pmol。另外,可以使用適配子從復雜的混合體系中選擇性地捕獲凝血酶。

3.4 適配子技術在其他方面的應用

在雙位點結合實驗模式中,核酸適配子既可作為捕獲分子又可作為檢測分子,已成功應用于血管內皮生長因子、CD4分子、凝血酶等靶分子的檢測。最近研究者嘗試將適配子同時作為捕獲分子和檢測分子進行雙位點結合實驗[28]。在熒光偏振分析中,適配子分子小,與小分子靶物結合后易引起構型改變,進一步增加偏振,在非競爭性熒光偏振分析有明顯優勢。Fang等[29]用熒光基團標記血小板來源生長因子(PDGF)的適配子,通過熒光偏振分析實時監控適配子與PDGF的結合,可以檢測到lnmol的PDGF?；诳贵w流式細胞技術存在一定局限,抗體分子較大,不易進行細胞內結合,與Fc受體存在非特異性結合,適配子的應用可在一定程度解決這些問題,提高檢測的可靠性,促進流式細胞術檢測的推廣應用。與蛋白質印跡原理相似,研究人員利用篩選出的針對金黃色葡萄球菌的適配子來檢測金黃色葡萄球菌[30]。

4 前景與展望

由于SELEX技術特點突出,因而具有良好的應用前景。凡是涉及抗體的診斷領域,幾乎都可以用適配子代替,特別是可以彌補抗體在診斷領域中應用的不足。在雙位點結合試驗模式中已有研究表明,適配子比單克隆抗體更適于難以區分的結構類似物或交叉免疫反應的鑒別診斷;在分子信標模式中,一般分子信標只能用于核酸的檢測,而新建立的適配子分子信標可以用于非核酸物質如蛋白質的檢測。此外,適配子在毛細管電泳、流式細胞術、熒光偏振等分析模式中都發揮著非常重要的作用;在傳感器方面,與抗體介導的免疫傳感器相比,適配子的特點是親和力高、特異性強,靶分子范圍非常廣,且穩定性好,可快速變性、復性,能反復使用、容易制備,便于長期保存和運輸。盡管適配子在生化分析領域的應用目前尚處于起步階段,相關報道也相對較少,但相信這類應用將會越來越多。展望未來,適配子將在分子生物學、疾病預防、臨床診斷、新藥開發、環境監測、食品衛生檢驗、生物毒素檢測、毒理學等領域顯示更加廣闊的應用前景。

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