EGF-IL-18在畢赤酵母中的表達

張歡，蔡小波，施曉琴，王震，呂建新

(溫州醫學院 浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035)

EGF-IL-18在畢赤酵母中的表達

張歡，蔡小波，施曉琴，王震，呂建新

(溫州醫學院 浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035)

目的：在甲醇營養型畢赤酵母表達系統中分泌表達人表皮生長因子受體干擾基序和白細胞介素-18（EGF-IL-18）融合蛋白。方法：PCR擴增EGF-IL-18基因，克隆到表達載體pPIC9K，重組質粒經線性化后用電轉化導入畢赤酵母GS115，篩選重組子，經搖瓶培養，用甲醇誘導表達EGF-IL-18融合蛋白。結果：序列分析表明，克隆到pPIC9K載體中的EGF-IL-18基因與設計相符，SDS-PAGE電泳分析顯示表達產物EGFIL-18以可溶性分子存在于酵母培養基中，Western印記表明表達產物EGF-IL-18具有良好的抗原性。結論：重組蛋白EGF-IL-18在畢赤酵母GS115中成功分泌表達。

重組融合蛋白質類；EGF-IL-18；克隆，分子；畢赤酵母

白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）又稱為IFN-γ誘導因子，于1996年由Ushio等克隆，其前體含193個氨基酸，成熟肽為157個氨基酸，以單體形式發揮作用。IL-18能促進T細胞和NK細胞增殖活化[1-2]。動物實驗表明，IL-18具有明顯的抗腫瘤作用[3]，但由于IL-18的效應細胞——Th1和NK細胞廣泛分布于人體各部位，容易激發炎癥反應，產生副作用[4]，因此，需要一種導向序列來加強IL-18對腫瘤細胞的靶向性。

另一方面，人表皮生長因子受體（EGFR）配體的第三個環狀結構保守基序（C-loop）可特異性結合腫瘤細胞表面的EGFR但并無活化EGFR的功能，被稱為EGF受體干擾基序[5]。這樣融合EGF受體干擾基序和IL-18成熟肽分子，能夠得到一個具有腫瘤細胞靶向性和抗腫瘤效應的多功能融合蛋白（EGFIL-18）[6-8]。

本研究通過構建pPIC9K-EGF-IL-18真核表達載體，轉化畢赤酵母，篩選獲得穩定表達EGF-IL-18蛋白的工程菌，為融合蛋白EGF-IL-18的下一步研究和應用打下良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株與質粒菌株E.coli DH-5α，質粒pFUSEGF-IL-18由本實驗室保存。pPIC9K，GS115購自invitrogen。

1.2酶與試劑EcoR I內切酶、Not I內切酶、Sac I內切酶、Ex Taq酶、T4DNA連接酶、Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit購自Takara。引物由Takara合成。Tryptone、Yeast extract購自英國OXOID公司。YNB、生物素、G418 購自上海生工。核酸分子量標準、蛋白質分子量標準購自碧云天。鼠抗人IL-18單克抗隆抗體購自MBL公司，ECL發光試劑盒購自珠海百奧公司。PVDF膜為美國BIO-RAD產品。

1.3 目的基因EGF-IL-18的擴增以含有EGF-IL-18基因的重組質粒pFUS-EGF-IL-18為模板，用引物primer1：5’-CCGGAATTCATGCGCTGCTCCCATG-3’（下劃線部分為EcoR I酶切位點）和primer2：5’-ATT TGCGGCCGCCTAGTCTTCGTTTTG-3’（下劃線部分Not I酶切位點）擴增EGF-IL-18基因。反應體系為25μL：模板1μL、引物各0.5μL、Ex Taq 酶0.2μL、MgCl22μL、dNTP 2μL，ddH2O 18.8μL。反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25個循環；最后72 ℃ 延伸10 min。

1.4 表達質粒的構建PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收約600 bp處條帶。EcoR I、Not I雙酶切后，經T4DNA連接酶連接于同樣酶切的表達載體pPIC9K，轉化感受態的大腸桿菌DH-5α，通過含氨芐青霉素的LB平板篩選，挑取單菌落于LB液體培養基培養，收集細菌，抽提重組質粒pPIC9KEGF-IL-18，進行酶切和PCR鑒定并測序(由Takara公司完成)。

1.5 表達質粒轉化酵母菌株按照Invitrogen公司畢赤酵母試劑盒操作指南的方法，將酵母菌GS115制備成感受態，取出80μL感受態細胞與5～10μg Sac I單酶切線性化的重組表達質?；旌?，轉入0.2 cm電轉杯，冰浴5 min，于1500 V，25μF，200 Ω條件下進行電轉化。將電轉化后的酵母細胞涂布于基本葡萄糖培養基（MD）選擇平板上，置于30 ℃培養2～3 d，觀察轉化子的生長。

1.6 多拷貝EGF-IL-18基因整合轉化子的篩選將MD培養基平皿中長出的最初His+轉化子，用影印法依次接種到含G418濃度梯度為0.25、0.5、0.75、1.0 mg/mL的YPD平板上，逐級篩選高G418抗性菌株。

1.7 轉化子的PCR檢測取篩選得到的高G418抗性單菌落中少量菌于沸水中煮5 min后作為模板，用引物5AOX1（5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’）和3AOX1（5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’）PCR擴增鑒定整合到酵母染色體上的目的基因，PCR條件：94℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.8 EGF-IL-18在畢赤酵母中的誘導表達挑取抗高濃度G418抗性的pPIC9K-EGF-IL-18的畢赤酵母轉化子，接種到BMGY培養液中30 ℃，200 r/min培養至OD600=6，離心收集酵母細胞，用BMMY培養液重懸培養，每隔24 h加甲醇至終濃度為1%，72 h后離心取培養基上清。

1.9 表達產物的Western blot檢測將培養基上清超濾濃縮后，用12% SDS-PAGE電泳鑒定表達產物的分子量。SDS-PAGE電泳結束后，轉移蛋白至PVDF膜上，用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉2 h。加一抗鼠抗人IL-18單克隆抗體4 ℃過夜，用TBST充分清洗3次后，加二抗HRP-conjugated Goat anti-Mouse IgG孵育2 h，然后用ECL法進行曝光。

2 結果

2.1 EGF-IL-18基因擴增以pFUS-EGF-IL-18質粒為模板進行PCR擴增。電泳后可見一條清晰的特異性擴增帶，擴增片段位于600 bp處左右與預計580 bp相符（見圖1）。

圖1EGF-IL-18基因PCR擴增圖

圖2重組質粒PCR及酶切鑒定圖

2.2重組質粒pPIC9K-EGF-IL-18的鑒定重組質粒pPIC9K-EGF-IL-18的EcoR I、Not I雙酶切產物以及PCR鑒定產物在約600 bp處出現條帶與預期EGFIL-18（580 bp）基因片段大小一致（見圖2）。對重組質粒進行測序分析，結果所克隆的基因序列與已知序列(Genebank：AF454397)的同源性為100%。

2.3 畢赤酵母高拷貝表達菌的篩選和轉化子的鑒定重組質粒pPIC9K-EGF-IL-18經Sac I酶酶切線性化，電穿孔轉化酵母GS115感受態細胞，篩選獲得抗1 mg/mL G418的酵母轉化子3個。PCR鑒定證實3個轉化子都整合含有目的基因，3個重組酵母菌株GS115/pPIC9K-EGF-IL-18都可擴出約1072 bp大小的片段，而重組酵母菌株GS115/pPIC9K只擴出約492 bp的條帶（如圖3所示）。

圖3畢赤酵母轉化子的PCR鑒定圖

圖4EGF-IL-18蛋白的SDS-PAGE和Western blot鑒定圖

2.4 融合蛋白誘導表達和Western blot鑒定重組酵母菌株GS115/pPIC9K-EGF-IL-18經甲醇誘導，離心收集培養基上清，超濾濃縮后，分別經12% SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍染色，結果表明甲醇誘導24、48、72 h的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-EGF-IL-18的表達產物在相對分子質量約21 kD處有一明顯的染色條帶，而重組酵母菌株GS115/pPIC9K的表達產物無該條帶（見圖4a）。Western blot結果進一步顯示，該21 kD處的蛋白條帶可與鼠抗人IL-18單克隆抗體發生抗原抗體反應（見圖4b），證實EGFIL-18蛋白在重組酵母菌株GS115/pPIC9K-EGF-IL-18中成功分泌表達。

3 討論

本課題組首次合成EGF-IL-18融合基因，并已成功在昆蟲桿狀病毒系統和原核系統中表達EGF-IL-18融合蛋白[7-8]。與本次實驗中利用酵母表達系統表達相比而言，昆蟲桿狀病毒系統同樣也是真核表達系統，但其EGF-IL-18蛋白產業化成本高于酵母表達系統。而利用原核表達系統表達EGF-IL-18融合蛋白時，目的蛋白產量最高，但是需經過較復雜的復性過程，且目的蛋白比活性低于真核表達的目的蛋白。本實驗嘗試利用酵母表達系統，希望在保持較高的目的蛋白比活的同時，提高真核系統的表達量，獲得較高產量、高比活的EGF-IL-18蛋白。

另外，利用酵母表達系統表達EGF-IL-18融合蛋白時，分泌性的表達質粒pPIC9K具有釀酒酵母信號肽α因子，當培養體系以甲醇為唯一碳源時，可強烈介導天然EGF-IL-18蛋白分泌到胞外，而信號肽α因子自身被信號肽酶識別切割，加之酵母自身分泌蛋白比較少，這樣就非常適合天然EGF-IL-18融合蛋白的分離，有效地降低了純化成本。

目前，畢赤酵母表達系統已廣泛應用于外源蛋白的表達[9]。某些細胞因子采用畢赤酵母表達系統表達后，蛋白分子量會大于實際分子量，比如IL-10經畢赤酵母分泌表達后其分子量為20.2 kD大于實際的18.5 kD[10]。而GS115/pPIC9K-EGF-IL-18的表達產物經SDS-PAGE電泳檢測，在約21 kD處有特異性條帶，與實際分子量21 kD相符。這是由于EGFIL-18蛋白不像IL-10等細胞因子那樣含有糖基化位點，因而通過畢赤酵母表達系統表達后不會出現蛋白糖基化而導致蛋白分子量增大現象。

分析SDS-PAGE結果，發現重組酵母菌經甲醇誘導24 h即可觀察到目的蛋白條帶，而經甲醇誘導72 h目的蛋白條帶未見明顯加深。這可能是由于隨著培養體系中酵母菌濃度的增加，其他一些細胞內物質如蛋白水解酶分泌表達也相應增多，從而導致重組蛋白逐漸被降解，最終蛋白表達量無法隨時間增加而提高。

總之，本實驗通過畢赤酵母表達系統，有效地表達了EGF-IL-18融合蛋白，為EGF-IL-18蛋白進一步研究奠定了良好基礎。

[1]Li W, Yamamoto H, Kubo S, et al. Modulation of innate immunity by IL-18[J]. J Reprod Immunol,2009,83(1-2): 101-105.

[2]Schneider BE, Korbel D, Hagens K, et al. A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis [J]. Eur J Immunol,2010, 40(2):396-405.

[3]Lian H, Jin NY, Li X, et al. Induction of an effective antitumor immune response and tumor regression by combined administration of IL-18 and Apoptin [J]. Cancer Immunol Immunother,2007,56(2):181-192.

[4]Dinarello CA. Interleukin-18 and the pathogenesis of in

flammatory diseases [J]. Semin Nephro,2007,27(1):98-114. [5]Lutsenko SV, Feldman NB, Severin SE. Cytotoxic and antitumor activities of doxorubicin conjugates with the epidermal growth factor and its receptor-binding fragment [J]. J Drug Target,2002,10(7):567-571.

[6]彭穎,呂建新. 人EGF受體干擾序列-ILl8融合基因構建及其表達產物結構預測[J]. 溫州醫學院學報,2003,33(5):289-291.

[7]Lu JX , Peng Y , Meng ZF, et al. Rational design of an EGFIL18 fusion protein: implication for developing tumor theraeutics [J]. Biochem Biophys Res Commun,2005,334(1):157-161.

[8]潘建華,彭穎,鄭昭暻,等. 重組人EGF-IL-18 融合蛋白的表達純化及復性[J]. 細胞生物學雜志,2006,28(5): 711-716.

[9]Li P, Anumanthan A, Gao XG, et al. Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris [J].Appl Biochem-Biotechnol,2007,142(2):105-124.

[10]井申榮,鄒全明,曾韋錕,等. 重組人白細胞介素10在畢赤酵母中的表達及生物活性測定[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 2005,25(9):773-776.

（本文編輯：吳健敏）

Expression of EGF-IL-18 in pichia pastoris

ZHANG Huan，CAI Xiaobo，SHI Xiaoqin，WANG Zhen，LV Jianxin.Zhejiang Provinicial Key Lab of Medical Genetics，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective: To express human epidermal growth factor receptor interferential motif and interleukin-18（EGF-IL-18）fusion protein in the methylotrophic pichia pastoris expression system. Methods:EGF-IL-18 gene was amplified by PCR， and then cloned into the expression vector of pPIC9K. The pPIC9K-EGF-IL-18 was linearized and electrotransformed into Pichia pastoris GS115. The recombinants were screened and then induced by methanol in shake flask cultures. Results: DNA sequencing analysis showed that the sequence of cloned EGF-IL-18 was accorded with that of designment. The recombinant EGF-IL-18 protein was detected in the culture medium by SDS-PAGE. Western blot results indicated that the recombinant EGF-IL-18 protein exhibited high antigenicity. Conclusion:The recombinant protein of EGF-IL-18 is successfully secretory expressed in Pichia pastoris GS115.

recombinant；fusion protein；EGF-IL-18；cloning molecular；pichia pastoris

book=7,ebook=14

Q78[

]A

]1000-2138 (2010)04-0322-05

2010-03-02

浙江省科技廳重大科技專項和優先主題計劃資助項目（2009C13038）；浙江省教育廳2008年度大學生科技創新活動計劃立項資助項目。

張歡（1984-），男，浙江溫州人，碩士生。

呂建新，教授，博士生導師，Email：jxlu313@163. com。

tected in the culture medium by SDS-PAGE. Western blot results indicated that the recombinant EGF-IL-18 protein exhibited high antigenicity. Conclusion:The recombinant protein of EGF-IL-18 is successfully secretory expressed in Pichia pastoris GS115.

recombinant；fusion protein；EGF-IL-18；cloning molecular；pichia pastoris

book=7,ebook=14

Q78

A

]1000-2138 (2010)04-0322-05

2010-03-02

浙江省科技廳重大科技專項和優先主題計劃資助項目（2009C13038）；浙江省教育廳2008年度大學生科技創新活動計劃立項資助項目。

張歡（1984-），男，浙江溫州人，碩士生。

呂建新，教授，博士生導師，Email：jxlu313@163. com。