北京市污水廠污泥中的內分泌干擾效應物質

陳月華，高潔，*，馬梅，饒凱鋒，李文忠，何春利，劉操

1.西南大學農學與生物科技學院，重慶400715

2.中國科學院生態環境研究中心 環境水質學國家重點實驗室，北京100085

3.北京市水利科學研究所，北京100085

北京市污水廠污泥中的內分泌干擾效應物質

陳月華1，高潔1，*，馬梅2，饒凱鋒2，李文忠3，何春利3，劉操3

1.西南大學農學與生物科技學院，重慶400715

2.中國科學院生態環境研究中心 環境水質學國家重點實驗室，北京100085

3.北京市水利科學研究所，北京100085

采用重組基因酵母法檢測了北京市16個污水處理廠污泥的雌激素、雄激素和孕激素效應.結果表明，各污水廠污泥中均可檢測到雌激素受體誘導效應，范圍在0.587～6.76ngEEQ·g-1（dw）之間.各水廠污泥均未檢測出雄激素誘導效應和孕激素誘導效應，大部分污水廠污泥樣品表現出較明顯的雄激素抑制效應和較強的孕激素抑制效應.與國外相比，北京市污水廠污泥中的雌激素活性值相對較低.堆肥處理不能有效去除雌激素類物質和孕激素抑制物質，但對雄激素抑制物質的去除明顯.

內分泌干擾物；生物測試；污水廠污泥

Received 8 January 2010 accepted 15 February 2010

Abstract：This study tested for estrogenic effect,androgenic effect and progestogenic effect of sewage sludge from sixteen sewage treatment plants in Beijing using a recombinant yeast bioassay.Estrogenic activity can be detected for all the sewage sludge,with rang from 0.587 to 6.76ngEEQ·g-1（dw）of estradiol equivalent.None of samples showed androgenic activity and progestogenic activity.However,major part of samples showed obviously inhibitory effect for androgen,and strong inhibitory effect for progestogen.In general,the estrogenic activity in the sludge in Beijing was lower than those reported elsewhere.The composting process could not remove efficiently estrogen-like chemicals or progestogenic inhibitors, but could remove efficiently androgenic inhibitor from sewage sludge.

Keywords：endocrine disruptive chemicals；bioassay；sewage sludge

1 引言（Introduction）

污水廠污泥的環境污染問題一直以來都是人們關注和研究的熱點.近年來隨著內分泌干擾物在水體中的廣泛分布，以及人們對污水處理過程中內分泌干攏物去除機制的認識（杜兵等，2004），隨污泥排放進入環境的內分泌干擾物問題引起了人們的高度重視.早期的一些研究已經證實污泥具有內分泌干擾效應.Waring等（1996）將污水處理廠污泥暴露于蝦虎魚、虎刺魚，結果發現50%的雌性蝦虎魚產卵受到明顯的抑制.Paul等（2005）發現在施用污泥的牧場上，公綿羊幼崽睪丸發育下降，內分泌系統也呈現失調狀態，而且影響持續至其成年期.伴隨著污泥的環境內分泌問題的相繼報道及污泥安全回用的呼聲日益高漲，對污泥進行內分泌干擾效應檢測和評價已成為一種緊迫的任務.

國內外對污泥的內分泌干擾效應研究目前相對較少，僅有的研究也局限于有限的內分泌干擾物分析.如莫測輝等（2001）和蔡全英等（2001）對我國不同城市污泥的有機污染物種類和含量進行了分析，并研究了鄰苯二甲酸酯在污泥中的分布和含量；Cheng等（2000）分析了臺灣城市污泥中鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、壬基酚（4-NP）的含量，進一步研究了不同環境條件下好氧消化污泥中DEHP的降解情況.然而污泥是一個復雜的混合體系，由各種酚類、多環芳烴、多氯聯苯、二噁惡英及鄰苯二甲酸鹽等有毒有害物質組成，化學分析很難對污泥中為數眾多的污染物進行逐一定量.生物測試方法簡便、快速、靈敏，能綜合評價環境樣品的內分泌干擾效應，目前已廣泛應用于環境水樣的內分泌干擾檢測（饒凱鋒等，2005;李劍等，2006;崔青等，2007）.

本研究采用重組人雌激素受體基因酵母、重組人雄激素受體基因酵母和重組孕激素受體基因酵母檢測了北京市16個污水處理廠共17個污泥樣品的雌激素效應、雄激素效應和孕激素效應，以期對北京市主要污水廠污泥的內分泌干擾物排放水平有一個大致的估算.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 樣品前處理

污泥樣品于2009年10月采集自北京市16個污水處理廠，以A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P表示.除D廠采集了生污泥和堆肥后消化污泥外，其它污水處理廠采集的均是生污泥.

采集的污泥經冷凍干燥（FD21冷凍干燥機，北京博醫康技術公司）后，研磨成粉末，過40目篩，避光保存.準確稱取1g污泥，用100mL丙酮：二氯甲烷（體積比為1：1）的混合液在索氏提取器中先浸泡過夜，再抽提24h.提取液用旋轉蒸發儀（瑞士Buchi）濃縮至1～2mL后，轉移至K-D濃縮器中，氮吹，最后加入500μL二甲基亞砜（DMSO）溶解.每個樣品均稀釋至6個濃度梯度，-20℃保存以待生物測試.

2.2 酵母菌的凍存與復蘇

重組孕激素受體基因酵母由Gaido教授贈送，采用添加有硫酸酮、腺嘌呤、賴氨酸、色氨酸的SC培養基.重組雌激素受體基因酵母和重組雄激素受體基因酵母為本實驗室自主構建，為穩定轉染有人雌激素基因片斷hER或人雄激素基因片斷hAR和共激活因子GRIP1的雙雜交酵母，主要采用缺乏亮氨酸和色氨酸的SD培養基.

將1mL新鮮凍融的酵母菌液加入到30mL培養液中，30℃、150rpm培養過夜.取過夜培養的菌液稀釋10倍于600nm處測定吸光度值，要求菌液的OD600為0.6～0.8.向培養基中加入體積分數為15%的無菌甘油，以1mL分裝于EP管中，按4℃→-20℃→-80℃逐步降溫，最后保存在-80℃冰箱中（莊麗麗等，2010）.

2.3 重組基因酵母測試

重組基因酵母測試方法參考以前的文獻（李劍等，2008;Ma et al.,2005;Li et al.,2008）.將過夜培養的菌液進行稀釋，加入培養基調節其吸光度至0.75左右.將995μL的酵母菌液與5μL的樣品渦旋混勻.取200μL的混合液加入到96孔板中，每個濃度設至少3個平行測試.同時每板設定陽性對照（2×10-10mol·L-1的17β-雌二醇或5×10-8mol·L-1的二氫睪酮或10-9mol·L-1的孕酮，分別對應于重組雌激素、重組雄激素和重組孕激素酵母）和陰性對照（DMSO）.為保證實驗數據的可靠性，所有樣品均做重復實驗.將96孔板置于微孔搖床（Heidolph TITRAMAX 1000,Hamburg,Germany）上，30℃、800rpm暴露培養 2h.以上均為無菌操作.測定 OD595的值（酶標儀 Tecan,GENios,Austria）.將培養板中的菌液吸出 150μL，加入120μL分析緩沖液（每100mL的基礎緩沖液中加入3.33mL濃度為0.1%的SDS溶液和270μL β-巰基乙醇.基礎緩沖液的配制：將 21.51g的Na2HPO4·12H2O、6.22g的 NaH2PO4·2H2O、0.75g的KCl和0.25g的MgSO4·7H2O溶解并定容于1L的蒸餾水中），30℃、800rpm繼續培養10min后加入20μL氯仿，于搖床上1300rpm振蕩10min破碎酵母細胞.加入40μL O-NPG（13.3mmol·L-1，溶解于基礎緩沖液中）啟動酶反應，計時直至出現明顯的黃色.反應完成后加入100μL碳酸鈉（1mol·L-1）終止.吸取200μL轉移到酶標板中，測定OD420值.

檢測樣品的抗激素效應則需將990μL的菌液與5μL樣品及5μL標準誘導劑（5×10-8mol·L-1的二氫睪酮或10-9mol·L-1的孕酮）共暴露培養，其它步驟與上述一致.

2.4 數據分析

β-半乳糖苷酶活性u值的計算：

式中：u為β-半乳糖苷酶活性（U）；t為酶反應時間（min）；V為反應體積（mL）；D為稀釋因子；OD′420為陰性對照在420nm處的吸光度值；OD420和OD595為樣品在420nm和595nm處的吸光度值.

樣品的雄激素效應和孕激素效應均以誘導率和抑制率表征，公式如下：

式中：u（s）為樣品誘導酵母產生的酶活性值；u（p）為陽性對照（二氫睪酮、孕酮）誘導酵母產生的酶活性值（莊麗麗等，2010）.

樣品的雌激素效應用17β-雌二醇標定：將樣品的酶活與實驗中測定的17β-雌二醇的劑量-酶活關系曲線對比后得到雌二醇當量值（EEQ）（李劍等，2008）.

雄激素誘導率和抑制率及孕激素誘導率和抑制率均以0.5mg污泥所誘導或抑制的β-半乳糖苷酶活性計算.

3 結果與分析（Results and analysis）

3.1 重組基因酵母體外測試

利用重組雌激素受體、雄激素受體和孕激素受體的酵母分別檢測了17β-雌二醇、二氫睪酮、孕酮的效應，通過函數擬合方程計算出EC50值（表1），與文獻報道的該3種物質在重組基因酵母中的結果類似（Rehmann et al.,1999;Sohoni and Sumpter, 1998;Death et al.,2004）.

表1 重組基因酵母檢測已知誘導劑的半數濃度Table 1 EC50values of the known agonists in the recombinant yeast bioassay

3.2 污泥樣品的重組基因酵母檢測

圖1 17個污泥樣品的雌激素受體誘導效應（1～4：污水處理廠A～D的生污泥樣品；6～17：污水處理廠E～P的生污泥樣品；5：D廠污泥的堆肥產物）Fig.1 The inductive effect of the seventeen sewage sludge on estrogen receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D;6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P;5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

17個污泥樣品的雌激素受體誘導效應如圖1所示.污泥樣品的雌激素受體誘導活性用17β-雌二醇的當量值EEQ表示.由圖1可見，17個污泥樣品雌激素受體誘導活性范圍在 0.587～6.76ngEEQ·g-1（dw）之間，其中以M廠的污泥EEQ值最高，C廠、E廠和O廠的污泥EEQ值相對較低，前者數值約為后者的10倍.采集于不同污水處理廠的污泥其雌激素活性顯示出一定的差距，可能與處理水源、處理水量、處理工藝及污泥類型等有關.D廠污泥雌激素活性為 2.04ngEEQ·g-1（dw），經堆肥消化處理后雌激素活性不但沒有消失，反而有所升高，增至3.58ngEEQ·g-1（dw）.分析其原因，可能與微生物作用有關.因為從人類或動物體內排出的雌激素是以非活化的共軛結合態形式存在（主要是葡糖酸苷和硫酸鹽形式），而伴隨著動物排泄而進入環境中的大腸桿菌能合成β-葡糖酸苷酶（Dray et al.,1972），通過降解葡糖酸苷解開共軛鍵使雌激素重新活化，雌激素效應得以增加.研究發現污水處理過程能夠釋放結合態的雌激素（Desbrow et al.,1998;Tyler and Routledge, 1998;Allen et al.,1999;Ternes et al.,1999）.經過堆肥處理后，結合態的雌激素被進一步釋放，所以消化后的污泥雌激素活性有一定的提高.據此，可以考慮在污泥樣品的前處理過程中加入活化的步驟，使結合態的雌激素得以全面釋放，以獲得更準確的數值.另外，Ternes等（2002）在研究污泥的內分泌效應過程中也發現，雌激素類物質可以伴隨著整個污泥消化過程.

Motoyama等（2006）用酵母雙雜交法檢測了21種由污泥和牲畜糞便制成的混合肥料的雌激素效應，發現13種具有明顯的雌激素活性.基于人雌激素受體的雙雜交酵母檢測值為14～168pmol·L-1（EEQ），比本研究的結果要高一些.原因可能是混和肥料里除了污泥外，還添加有牲畜糞便，而牲畜糞便是環境激素的一個重要來源.為了促進牲畜的生長，飼料里添加了許多促生長劑包括雌激素類物質，這些物質隨牲畜的排泄物進入周圍環境.文獻報道的德國兩個污水處理廠的活性污泥中雌激素的含量分別為5ng·g-1和17ng·g-1（Ternes et al.,2002），也高出本研究的結果.

一些環境污染物既能模擬內源激素與受體結合誘導基因表達，也能與內源激素競爭核受體抑制基因表達，即同時表現出誘導效應與抑制效應.鑒于此，本實驗同時檢測了樣品的雄激素誘導效應和抑制效應及孕激素的誘導效應和抑制效應.表2結果顯示，除D廠污泥堆肥、G廠污泥和O廠污泥未檢出雄激素誘導活性外，其余水廠污泥均顯示一定程度的雄激素活性；反之，除A廠、E廠、H廠、I廠和M廠的污泥檢測出孕激素誘導活性外，其余水廠污泥均未檢出此效應.各樣品雄激素誘導率和孕激素誘導率均在10%以下（表2），因此17個樣品均不顯示顯著的雄激素誘導效應和孕激素誘導效應（Hamers et al.,2006）.在Motoyama等（2006）的研究中也發現，21種由污泥制成的混合肥料中僅2種表現出雄激素活性，總活性值范圍在5～75pmol·L-1（以二氫睪酮當量值AEq表示）之間，雄激素活性值與本實驗結果相似.家畜排放的激素中，孕激素的量遠大于雄激素，雌激素則相對較少（Lange et al.,2002）.然而孕激素在污水中更易降解（Labadie and Budzinski,2005）；另據報道經活性污泥處理48h后，也有超過50%的孕激素被降解（Norpoth et al.,1973），這可能是污泥的孕激素誘導活性值較低的原因.

表2 北京城市污泥的雄激素誘導效應和孕激素誘導效應Table 2 The androgenic activity and progestogenic activity of municipal sludge in Beijing

抑制實驗結果表明，雄激素受體抑制效應除C廠污泥未檢出外，其余樣品均有檢出（圖2）；孕激素受體抑制效應除A廠污泥未檢出外，其余樣品均顯示較強的效應（圖3）.D廠污泥經堆肥處理后，雄激素抑制率在10%以下，抑制效果已不明顯，說明堆肥消化處理在雄激素抑制物質的去除中起到了關鍵的作用（圖2）.但堆肥消化處理對孕激素抑制物質的去除并不顯著（圖3）：孕激素抑制率僅由消化前的66.62%降低到消化后的57.48%，因而認為堆肥處理不能有效去除孕激素抑制物質.

內分泌干擾物對動植物及人類具有一定的毒害，有關這方面的研究報道已有不少.王曉娟等（2003）發現添加有酞酸酯類化合物鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的擬南芥莖段愈傷組織誘導率低；顯微切片結果顯示DBP會干擾擬南芥試管的形態發生.Norrgren等（1993）、Engwall等（1994）、袁秀平等（1999）和張鳳君等（2001）都在研究中發現當環境激素進入魚體時，魚體的代謝會受到影響尤其是肝臟受到損傷；對于性腺的影響主要表現為雌化、兩性、畸形等.除此之外，內分泌干擾物能引起人的神經系統的功能障礙，對免疫系統和生殖系統的影響也較大.污泥農用如今已成為世界各國主要的污泥處置方式.若將本研究中的污泥不經過處理直接農用，污泥中的內分泌干擾物會通過植物的根系吸收與污泥中的營養元素一起進入植物體內，影響植物的生長發育.因為大多數內分泌干擾物具有親脂性或不易降解性，所以通過生物富集和食物鏈的逐級放大作用最后可能造成體內蓄積，進而影響人類健康及生態系統的平衡.污泥的堆肥處理是一種較普遍的資源化利用方式.但本研究發現污泥經堆肥處理后其所含的內分泌干擾物并不能夠完全去除：孕激素抑制物質仍然存在，雌激素類物質反而有所增加.因而進一步推測，污泥堆肥化制成的復合肥在一定程度上存在著潛在的危害性.

圖2 17個污泥樣品的雄激素受體抑制效應（1～4：污水處理廠A～D的生污泥樣品；6～17：污水處理廠E～P的生污泥樣品；5：D廠污泥的堆肥產物）Fig.2 The inhibitory effect of the seventeen sewage sludge on androgen receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D; 6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P; 5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

圖3 17個污泥樣品的孕激素受體抑制效應（1～4：污水處理廠A～D的生污泥樣品；6～17：污水處理廠E～P的生污泥樣品；5：D廠污泥的堆肥產物）Fig.3 The inhibitory effect of the seventeen sewage sludge on progesterone receptor（1～4:primary sludge samples of sewage treatment plants A～D; 6～17:primary sludge samples of sewage treatment plants E～P; 5:digested sludge sample of sewage treatment plant D）

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The Endocrine Disrupters of Municipal Sewage Sludge in Beijing

CHEN Yue-hua1，GAO Jie1，*，MA Mei2，RAO Kai-feng2，LI Wen-zhong3，HE Chun-li3，LIU Cao3
1.College of Agronomy and Biotechnology,Southwest University,Chongqing 400715
2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085
3.Beijing Hydraulic Research Institute,Beijing 100085

1673-5897（2010）2-215-07

X882.5，X131.3

A

高潔（1959—），女，博士，西南大學農學與生物科技學院教授，碩士生導師，主要從事生態學、植物生理學、生物化學等的研究.

2010-01-08 錄用日期：2010-02-15

國家高技術研究發展計劃（863） 探索導向項目（No.2007AA06Z414）；國家高技術研究發展計劃（863） 項目（No. 2007AA06A407）；北京市科技計劃項目（No.KY-2009-03）

陳月華（1983—），女，碩士研究生，E-mail:waic2009@sina.com；*通訊作者（Corresponding author），E-mail: gaojiexn@sohu.com