生長相關蛋白GAP-43多肽抗體的制備

姬志娟，盛樹力，王 蓉 ，趙志煒，張景艷，孟祥宏，張 旭

(首都醫科大學宣武醫院 中心實驗室，神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

生長相關蛋白GAP-43多肽抗體的制備

姬志娟，盛樹力，王 蓉 ，趙志煒，張景艷，孟祥宏，張 旭

(首都醫科大學宣武醫院 中心實驗室，神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

目的 對生長相關蛋白-43(growth associated proteins-43，GAP-43)進行抗原表位分析并制備兔多克隆抗體。方法 通過對GAP-43 cDNA序列及氨基酸序列的結構進行生物信息分析，依據蛋白質的二級結構、親水性、疏水性、抗原性及理化特性，經過同源性檢索后，綜合考慮抗體設計的其他因素，選出具有免疫活性的抗原決定簇多肽片段，采用有機固相多肽合成法合成了GAP-43的多肽片段，并與載體蛋白血藍蛋白(KLH)偶聯制備成抗原，免疫新西蘭家兔。結果 ELISA測定GAP-43抗體效價為1∶32 000;Western blot檢測結果顯示:在分子量25 kDa出現單一條帶;免疫組織化學法檢測顯示:GAP-43蛋白在小鼠海馬神經元中有表達;免疫細胞化學法檢測顯示:GAP-43蛋白在人神經母細胞瘤株SH-SY5Y中存在表達。結論 利用生物信息學軟件比較準確地預測GAP-43的抗原決定簇，并成功制備了高效價、高特異性的多肽抗體。

生長相關蛋白-43;多肽合成;抗體制備

生長相關蛋白-43(growth associated proteins-43，GAP-43)是神經元特異性磷蛋白，由238個氨基酸組成。目前已知其功能十分重要，是決定神經元發育和再塑的內在因素［1，2］。GAP-43 存在于軸突生長錐，因其在神經損傷情況下表達顯著增加，常被作為研究神經再生/再塑的分子標志物［3－5］。因此，制備抗GAP-43抗體對于分子水平上研究神經損傷與再生具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant， IFA)，血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，四甲基聯苯胺購自美國 Sigma公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔的二抗和DylightTM488標記山羊抗兔IgG(重鏈+輕鏈)購自北京中山金橋生物技術有限公司。

多肽自動合成儀購自美國應用生物系統公司(ABI-431A型)，旋轉蒸發儀購自日本Yamato公司，冷凍干燥儀購自美國 Virtis公司，新西蘭大白兔購自北京富豪實驗動物研究所，合格證號SCXK(京)2005-0009，高效液相色譜(HPLC)購自美國 Waters公司，酶聯儀購自法國巴斯德公司。

1.2 多肽抗原表位設計

根據互聯網提供的公共數據庫和軟件對GAP-43蛋白進行抗原表位分析。小鼠的GAP-43蛋白由227個氨基酸組成，大鼠226個氨基酸組成，人是由238個氨基酸組成，等電點為4.64，利用計算機生物分析軟件分析GAP-43的氨基酸序列以及蛋白質的二級結構、抗原性、親水性、疏水性、結合位點及氨基酸的帶電性等，設計一段15個氨基酸的多肽。將設計好的多肽再返回到蛋白數據庫中進行匹配，檢測該序列的特異性。

1.3 多肽抗原制備

采用有機固相合成法合成多肽，固相載體用HMP樹脂，保護氨基酸采用 Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbony，)保護的氨基酸，從多肽羧基端向氨基端合成，用TFA法裂解肽樹脂，經減壓蒸餾和乙醚萃取等方法處理后而得到粗品多肽。再用高效液相反相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)進行純化，純化后的樣品再用HPLC分析，純度為95%。將純化后的多肽冷凍抽干。

取純化后的多肽與血藍蛋白偶聯，偶聯方法是用碳化二亞胺法［1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，EDC］進行縮合反應，得到多肽-血藍蛋白偶聯物(免疫原)。

1.4 GAP-43多肽抗體制備

新西蘭大白兔2只，雄性，經過檢疫無病原菌的一級動物，體重為1.5 kg左右，免疫前行耳靜脈采血分離血清，凍存作為陰性對照血清。

基礎免疫:取多肽抗原-KLH 2 mg/mL與等量CFA充分乳化后于兩只兔背部皮下多點注射，每次免疫的抗原量約1000 μg/只。

加強免疫:第1次免疫后間隔2～3周，再以1 mg/1mL抗原加等體積的IFA充分乳化后注入兔背部皮下多點加強免疫。而后每隔2周按第二次免疫法重復加強免疫5～6次。每次免疫后的第10～14天，從兔耳靜脈采血測定抗體效價，直至獲得滿意的抗體效價后，行頸動脈插管取血，分離血清。

1.5 ELISA檢測多肽抗體效價

將GAP-43多肽溶于0.05 mol/L，pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液，濃度為 2 μg/mL，每孔 100 μL包被酶標板，4℃過夜，1×PBS-T洗滌，加1%BSA的PBS封閉緩沖液，37℃溫育(incubation)1 h，封閉，1×PBS-T洗滌。同時將兔抗血清稀釋成:1∶500;1∶1000;1∶2000;14 000;1∶8000;1∶16 000;1∶32 000不同濃度，每孔加 100 μL，37℃ 孵育半小時，1× PBS-T洗滌并吸干全部液體，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h洗滌，加入顯色劑四甲基聯苯胺(TMB)顯色劑 A和 B液各100 μL/孔，避光顯色10 min，加終止液2 mol/L硫酸50 μL，450 nm處測定其A值。

1.6 多肽抗體純化

硫酸銨鹽析法:硫酸銨鹽析須經過多次沉淀，第一次用40%飽和度，第二次用35%飽和度，第三次用33%飽和度，經三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。再經離子交換層析法提取 IgG。離子交換劑用的是DEAE纖維素-52。經酸處理并在0.05 mol/L pH 7.5～8.6的磷酸鹽緩沖液中平衡，將水分抽干，稱濕重1 g加于10mL血清中，在室溫30 min后，離心或過濾除去離子交換劑。上清液再如此處理一次，即獲得較純的IgG，純度95%。

1.7 多肽抗體特異性鑒定

1.7.1 Western blot:將大鼠脊髓組織蛋白裂解液與上樣緩沖液混合，變性，進行12%SDS-PAGE，電泳，轉至PVDF膜，麗春紅染色檢查轉膜效果及有無氣泡。將膜置于5% 脫脂奶粉封閉，按1∶4 000加入GAP-43多肽抗體，后續步驟按Western blot印跡常規方法溫育二抗(1∶3 000)，ECL化學發光、顯影。

1.7.2 免疫組織化學:取正常小鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，4%的多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，投入含30%蔗糖的多聚甲醛后固定液中，24 h換新的后固定液，4℃保存。

將腦標本從后固定液中取出，行冠狀面冰凍切片，厚度40 μm，待海馬出現后，保留切片。GAP-43多肽抗體免疫組織化學染色:將切片置于3%H2O2室溫孵育10 min，10%封閉用山羊血清室溫30 min，加入稀釋好的GAP-43抗體(1∶3000～9000)，室溫2 h，4℃孵育過夜。加入生物素標記的羊抗兔抗體(二抗，稀釋度為1∶300)，室溫孵育2 h。加入 HRP標記的抗生物素抗體(三抗，稀釋度為1∶300)，室溫孵育2 h。用DAB工作液顯色2 min左右，鏡下觀察染色背景，終止顯色反應。

1.7.3 免疫細胞化學:人神經母細胞瘤株SHSY5Y細胞來自瑞典卡羅琳斯卡研究所，細胞培養條件為10%胎牛血清的MEM培養基，于37℃ 5%CO2培養箱中培養，6 d傳代1次，中間換液1次。

采用免疫熒光化學方法進行檢測:將細胞以1×104密度接種于35mm培養皿，3 d后待細胞形態飽滿、軸突伸長，棄去培養液，4%多聚甲醛固定30 min。加入 GAP-43多肽抗體(1∶2000～6000)4℃過夜，熒光標記的羊抗兔IgG(1∶300)2 h，熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。

1.7.4 多肽抗原吸收實驗:用多肽片段100 μg與抗體(1∶1000稀釋)結合，37℃反應30 min后，進行ELIAS檢測(方法同1.5)。

2 結果

2.1 ELISA試驗檢測抗體效價

ELISA檢測GAP-43兔多肽抗體效價顯示，抗體滴度可達1∶32 000以上。說明該抗體靈敏度較高，可滿足實驗需要。

2.2 多肽抗體的特異性檢測

2.2.1 Western blot結果顯示，在25 kDa處有一條明顯的特異性蛋白條帶，說明該抗體特異性識別GAP-43蛋白(圖1)。

圖1 大鼠脊髓GAP-43 Western blot結果Fig.1 Western blot results of GAP-43 in the rat spinal cord

2.2.2 免疫組織化學染色結果顯示，在小鼠的海馬神經組織中可見GAP-43免疫反應陽性細胞，細胞呈多角形，在細胞漿和突起中均有棕色陽性顆粒分布，說明GAP-43蛋白在神經組織中有表達(圖2)。

2.2.3 免疫熒光細胞化學結果顯示，在人神經母細胞瘤株SY5Y的細胞中可見GAP-43免疫反應陽性細胞，細胞呈星形，在細胞漿和突起中均有明亮的陽性表達，而細胞核呈陰性表達，說明GAP-43蛋白在人神經母細胞瘤株SY5Y的細胞中有表達(圖3)(圖2，3 見彩插 2)。

2.2.4 吸收實驗結果為陰性，證明GAP-43抗體為特異性抗體。

3 討論

隨著人類蛋白質組計劃及后基因組計劃的深入開展，越來越多的新基因所編碼的蛋白質功能亟待闡明，而抗體是研究蛋白質功能必不可少的工具。在一個新的基因被成功克隆后，依據推導出的氨基酸序列人工合成活性多肽片段，制備抗多肽的抗體，再用于該基因和蛋白質的功能研究是一個行之有效的手段［6］。

在天然蛋白質分子中，肽鏈按一定的規律折疊形成空間結構，其中某些肽段暴露于分子表面，而另一些肽段深藏于分子內部，因此，并非所有的肽段都能形成有效的抗原決定簇，只有暴露于分子表面并形成一定空間結構的肽段才能作為抗原表位，刺激抗體產生并與產生的相應抗體結合［7］。本實驗正是應用此原理，成功預測了GAP-43的多肽抗原表位，經過與血蘭蛋白耦聯后制備成大分子抗原，免疫家兔，得到抗血清，經ELISA試驗檢測抗體效價為大于1∶32 000，可以用于實驗研究。

除抗體的效價外，抗體與不同條件下抗原的結合能力及其特異性是檢測抗體質量的另一標準。有些肽段形成的抗原決定簇在變性條件下會受到破壞，抗這些肽段的抗體將不能用于Western印跡，因此在制備抗人工合成多肽的抗體后有必要對其進行鑒定［7］。本課題組研究發現，自行制備的GAP-43多肽抗體能與變性后的大鼠脊髓組織中的GAP-43結合，在大約50 kDa的分子量部位出現單一條帶，這是由于GAP-43分子中含有大量酸性氨基酸對電泳行為造成影響［8］，說明該多肽抗體能與不同條件下的GAP-43抗原特異性結合;同時，經小鼠海馬神經組織的免疫組織化學染色，也見到免疫反應陽性細胞，說明該抗體可以用于檢測在體組織的GAP-43蛋白質表達情況。

總之，本課題組通過人工合成多肽抗原決定簇片段、免疫動物、制備抗血清的方法，成功得到可以用于實驗研究的GAP-43多肽抗體。

［1］Denny JB.Molecularmechanisms， biologicalactions， and neuropharmacology of the growth-associated protein GAP-43［J］.Current Neuropharmacology，2006，4:293－304.

［2］Marklund N，Bareyre MF，Royo CN，et al.Cognitive outcome following brain injury and treatment with an inhibitor of Nogo-A in association with an attenuated downregulation of hippocampal growth-associated protein-43 expression［J］.Neurosurg，2007，107(4):844－853.

［3］朱寧，馬駿，曾少舉，等.GAP-43，Netrin-1，Collapsin-1和Neuropilin-1在出生后小鼠小腦中的動態表達［J］.生物化學與生物物理進展，2009，36(6):750～760.

［4］付雙林，張劍濤，趙景偉，等.大鼠顱腦外傷后生長相關蛋白在中樞神經系統的表［J］.中國生物制品學雜志，2009，22(7):643－646.

［5］鄒佳，李長清.腦缺血再灌注大鼠GAP-43和 RhoA蛋白表達及 NEP1240對其的影響.第三軍醫大學學報，2009，31(12):1177－1180.

［6］Reimer J，TurckF.Genome-wide mapping of protein-DNA interaction by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization(ChIP-chip).PartA: ChIP-chip molecular methods.Methods Molecular Biology，2010;631:139－160.

［7］Schroeder J， Cavacini L. Structure and function of immunoglobulins.J Allergy Clinical Immunology，2010，125(2 Suppl 2):S41－52.

［8］段小莉，黃文晉，王百忍，等.GAP-43原核表達載體的構建、表達及抗GAP-43單克隆抗體的制備［J］.細胞與分子免疫學雜志，2003，19(5):482.

Preparation of Growth Associated Proteins-43(GAP-43)Polyclone Antibody

JI Zhi-Juan，SHENG Shu-Li，WANG Rong，ZHAO Zhi-Wei，ZHANG Jing-yan，MENG Xiang-hong，ZHANG Xu
Central Laboratory，Key laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education，Xuanwu Hospital of Capital Medical University.Beijing 100053，China.

Objective To analyze the epitope of rat and mouse growth associated proteins-43(GAP-43)and prepare its polyclonal antibody.Methods The GAP-43 full-length sequence was analyzed by bioinformatics to detect the structure of amino acids and select its epitope.GAP-43 peptides fragment was synthesized by solid-phase peptide synthesis method and purified by HPLC.The peptide was conjugated with keyhole limpet hemocyanin(KLH)，and used to immunize rabbits.Results The antibody dilution was 1∶32000，determined by ELISA.Western blot showed high activity and specificity of the antibody.A single band of 25 kDa was detected.Immunocytochemical staining showed the expression of GAP-43 in hippocampus CA1 region in mice.Immunohistochemical staining showed the expression of GAP-43 in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y cells.Conclusion A GAP-43 antibody has been prepared successfully.

GAP-43;Peptide synthesis;Antibody，preparation;Mouse;Rat

2392-33

A

1671-7856(2010)08-0022-04

2010-04-25

圖2 小鼠海馬神經組織GAP-43兔疫組化染色結果（抗體稀釋度1:2000）
Fig.2 Results of immunohistochemical staining of GAP-43 in the mouse hippocampus.(antibody dilution 1:2000)

圖3 人神經母細胞瘤株SH-SY5Y GAP-43兔疫熒光細胞化學染色結果（抗體稀釋度1:2000）
Fig.3 Results of immunofluorescence cytochemical staining of GAP-43 in the human blastoma cell line SH-SY5Y cells (antibody dilution 1:2000)

國家“十一五”863計劃“疫苗與抗體工程”(2006AA02A245);首都醫學發展科研基金(2007-3108);北京市衛生系統高層次衛生技術人才計劃資助項目(2009-3-64)。

姬志娟(1957－)，主管技師，從事多肽合成、純化、抗體制備工作。

王蓉，研究員，博士研究生導師，從事神經元退行性變的發病機理和防治策略研究。