基質金屬蛋白酶－2、－9及其組織抑制劑－1在大鼠肺組織中的增齡變化

李小瑩，王 蓉，聶秀紅，李 林，暢 怡，趙松林，萬歲桂，孫雪梅，徐 娟

(1.首都醫科大學宣武醫院呼吸內科;2.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，神經變性病教育部重點實驗室;3.首都醫科大學宣武醫院血液科流式細胞室，北京 100053)

基質金屬蛋白酶－2、－9及其組織抑制劑－1在大鼠肺組織中的增齡變化

李小瑩1，王 蓉2，聶秀紅1，李 林2，暢 怡1，趙松林1，萬歲桂3，孫雪梅3，徐 娟3

(1.首都醫科大學宣武醫院呼吸內科;2.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，神經變性病教育部重點實驗室;3.首都醫科大學宣武醫院血液科流式細胞室，北京 100053)

目的 研究基質金屬蛋白酶(MMPs)－2、－9及組織型基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)－1在大鼠肺組織中的增齡性變化規律。方法 不同月齡(1月齡、3月齡、12月齡、18月齡、24月齡)雄性清潔級(SD)大鼠47只分為5組，按月齡取實驗大鼠的右下葉肺組織，用流式細胞術檢測MMP－2、MMP－9及TIMP－1的表達水平，進行定量分析。結果 MMP－2、MMP－9和 TIMP－1均隨著月齡的增長呈先降后升波谷型曲線變化;3月齡、12月齡和18月齡MMP－2、MMP－9 和 TIMP－1 均較 1 月齡明顯下降，且以12 月齡為最低值;24 月齡 MMP－2、MMP－9 和 TIMP－1 均較 1 月齡上升。MMP－2/TIMP－1比值和MMP－9/TIMP－1比值均隨著月齡的增長呈先升后降波峰型曲線變化;12月齡和18月齡均較1月齡明顯升高，且以18月齡為最高點;3月齡的 MMP－2/TIMP－1較1月齡有所上升，3月齡的 MMP－9/TIMP－1與1月齡持平;24月齡的 MMP－2/TIMP－1和MMP－9/TIMP－1較1月齡也有不同程度上升。結論 大鼠肺組織中MMPs及其抑制劑TIMPs隨月齡的增長，呈特征性變化規律。

基質金屬蛋白酶;基質金屬蛋白酶組織抑制劑;大鼠肺組織;增齡;流式細胞術

肺臟老化是人類衰老的一部分，在人體各器官中，肺是最早出現老化從而功能衰退的器官之一。目前，有關肺老化的機理所知尚少。肺老化的發生是由于肺內細胞和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)發生衰老性改變的結果［1］。在正常肺組織中ECM能維持肺泡結構，它的合成與降解保持動態平衡，這對于保證正常肺功能非常重要;平衡破壞時，將會產生肺結構改變。構成ECM的IV型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等成分均為基質金屬蛋白酶(matrix met alloproteinases，MMPs)的作用底物，能被MMPs降解?；|金屬蛋白酶(MMPs)及其組織抑 制 劑 (tissue inhibitors ofmet alloproteinases，TIMPs)的失衡可導致ECM的動態平衡被破壞。目前系統研究MMPs、TIMPs與肺臟老化的報道較少。為此，我們通過觀察不同月齡大鼠肺組織中 MMP－2、－9及其抑制劑 TIMP－1的表達，研究其在大鼠肺組織中的增齡性變化規律，探討肺老化可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

實驗用雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠47只，購自北京大學醫學部實驗動物科學部［SCXK(京2002－0001)］。按不同月齡將大鼠分為5組:1月齡(1M)組10只;3月齡(3M)組9只;12月齡(12M)組11只;18月齡(18M)組11只;24月齡(24M)組6只。按晝夜時程，在室溫及穩定濕度條件下，用全價配合飼料喂養。

1.2 主要試劑

山羊抗大鼠 MMP－9抗體 IgG、山羊抗大鼠MMP－2抗體 IgG、山羊抗大鼠 TIMP－1抗體 IgG及間接免疫熒光標記物異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的兔抗山羊 IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)(山東濟南希森美康醫用電子有限公司);1∶10稀釋紅細胞裂解液(美國 BD公司);4%多聚甲醛(paraformaldehyde)溶液為自制。

1.3 實驗儀器

美國BD公司生產的FCS Calibur流式細胞儀，激發光源為氬離子激光器，輸出功率15 mW，激發光波長為488 nm。所測數據采用Cell Quest軟件進行分析。

1.4 標本采集

按月齡取實驗大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取大鼠的右下葉肺組織用4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 標本制備

單細胞懸液的制備［2－3］:將 4% 多聚甲醛溶液固定的肺組織以網搓法制備單細胞懸液。4℃冰箱保存48 h內上流式細胞儀進行檢測。

1.6 流式細胞儀檢測方法及定量分析

流式細胞儀檢測術(flow cytometry，FCM)［2－3］。采用流式細胞儀進行單參數檢測，所測數據經Cell Quest軟件進行分析，細胞的每一個單參數測量數據用直方圖來顯示，圖中橫坐標表示熒光信號相對強度值，其單位是“道數”(Channel);縱坐標表示細胞數。確定陽性峰后，以陽性峰的平均熒光強度表示MMP－2、MMP－9 及 TIMP－1 的表達水平。

1.7 統計學方法

用SPSS11.5軟件包處理數據，進行統計分析。正態性檢驗采用T檢驗;各組間進行單因素方差分析，若差異有顯著性意義，進一步做兩兩比較 q檢驗。計量資料以均數±標準差(±s)表示，P＜0.05為差異具有顯著意義。

2 結果

2.1 MMP-2、MMP-9在不同月齡大鼠肺組織中的表達

MMP－2和MMP－9均隨著月齡的增長呈先降后升波谷型曲線變化;3月齡、12月齡和18月齡MMP－2和 MMP－9均較1月齡明顯下降，且以 12月齡為最低值，差異有統計學意義(P＜0.05);24月齡MMP－2和 MMP－9均較1月齡上升，但差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

表1 MMP－2、MMP－9在不同月齡大鼠肺組織中的表達(±s)Tab.1The expression of MMP－2 and MMP－9 in lung tissue of rats at different ages(±s)

表1 MMP－2、MMP－9在不同月齡大鼠肺組織中的表達(±s)Tab.1The expression of MMP－2 and MMP－9 in lung tissue of rats at different ages(±s)

注:?與組1比較 P＜0.05;?與組3比較 P＜0.05;?與組12比較 P＜0.05;?與組18比較 P＜0.05;?與組24比較 P＜0.05Note:?vs.the 1－month group，P ＜0.05;?vs.the 3－month group，P ＜0.05;?vs.the 12－month group，P ＜0.05;?vs.the 18－month group，P ＜0.05;?vs.the 24－month group，P ＜0.05

Group MMP－2 MMP－9 1月齡組 1－month(n=10)129.44±22.45??? 122.83±20.83組別???3月齡組 3－month(n=9)72.85±16.75???67.82±20.46???12月齡組 12－month(n=11)72.20±17.48??? 66.98±18.43???18月齡組 18－month(n=11)100.84±18.94???? 88.95±15.07????24月齡組 24－month(n=6)141.52±20.02??? 142.60±31.81???

2.2 TIMP-1在不同月齡大鼠肺組織中的表達

TIMP－1隨著月齡的增長呈先降后升波谷型曲線變化;3月齡、12月齡和18月齡TIMP－1均較1月齡明顯下降，且以12月齡為最低值，差異有統計學意義(P＜0.05);24月齡 TIMP－1較1月齡上升，但差異無顯著性(P＞0.05)。見表2。

表2 TIMP－1在不同月齡大鼠肺組織中的表達(±s)Tab.2 The expression of TIMP－1 in lung tissue of rats at different ages(±s)

表2 TIMP－1在不同月齡大鼠肺組織中的表達(±s)Tab.2 The expression of TIMP－1 in lung tissue of rats at different ages(±s)

注:?與組1比較 P＜0.05;?與組3比較 P＜0.05;?與組12比較 P＜0.05;?與組18比較 P＜0.05;?與組24比較 P＜0.05Note:?vs.the 1－month group，P ＜0.05;?vs.the 3－month group，P＜ 0.05;?vs.the 12－month group，P ＜ 0.05;?vs.the 18－month group，P ＜0.05;?vs.the 24－month group，P ＜0.05

組別Group TIMP－1 1月齡組 1－month(n=10)150.34±21.78???3月齡組 3－month(n=9)83.25±22.30??12月齡組 12－month(n=11)73.81±23.06??18月齡組 18－month(n=11)92.32±18.52??24月齡組 24－month(n=6)161.13±43.02???

2.3 MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 在不同月齡大鼠肺組織中的表達

MMP－2/TIMP－1 比值和 MMP－9/TIMP－1 比值均隨著月齡的增長呈先升后降波峰型曲線變化;12月齡和18月齡均較1月齡明顯升高，且以18月齡為最高點，差異有統計學意義(P＜0.05);MMP－2/TIMP－1 的 3 月齡較 1 月齡有所上升，MMP－9/TIMP－1的3月齡與1月齡持平，差異均無顯著性 (P＞0.05);MMP－2/TIMP－1 和 MMP－9/TIMP－1 的 24 月齡較1月齡也有不同程度上升，但差異均無顯著性(P＞0.05)。見表3。

表3 MMP－2/TIMP－1、MMP－9/TIMP－1 在不同月齡大鼠肺組織中的表達(±s)Tab.3 The ratios of MMP－2/TIMP－1 and MMP－9/TIMP－1 expressions in the lung tissues of rats at different ages(±s)

表3 MMP－2/TIMP－1、MMP－9/TIMP－1 在不同月齡大鼠肺組織中的表達(±s)Tab.3 The ratios of MMP－2/TIMP－1 and MMP－9/TIMP－1 expressions in the lung tissues of rats at different ages(±s)

注:?與組1比較 P＜0.05;?與組3比較 P＜0.05;?與組12比較 P＜0.05;?與組18比較 P＜0.05;?與組24比較 P＜0.05Note:?vs.the 1－month group，P ＜0.05;?vs.the 3－month group，P＜ 0.05;?vs.the 12－month group，P ＜ 0.05;?vs.the 18－month group，P ＜0.05;?vs.the 24－month group，P ＜0.05

Group MMP－2/TIMP－1 MMP－9/TIMP－1 1月齡組 1－month(n=10)0.86±0.11?? 0.82±0.10組別??3月齡組 3－month(n=9)0.89±0.07?? 0.82±0.14?12月齡組 12－month(n=11)1.00±0.12??? 0.92±0.10?18月齡組 18－month(n=11)1.10±0.05????0.97±0.11??24月齡組 24－month(n=6)0.91±0.13?0.90±0.10

3 討論

人的老化是一個漫長的過程，從出生、生長、發育、成熟、衰老到死亡是一個必然的不可逆轉的連續的漸進過程。人體發育至20～30歲成熟，體細胞數和器官重量不再增加，各項生理功能達到峰值。此后開始衰退，并隨增齡而加速。作為人體重要組成部分的呼吸系統亦不例外地經歷著這一過程［4］。

王蓉等［5］應用電子顯微鏡對不同年齡組大鼠的海馬和皮層神經元超微結構進行了觀察，研究表明其存在明顯的隨增齡變化趨勢。但肺組織增齡性變化規律報道很少。曾有文獻報道［1］肺老化時肺內纖維連接蛋白增多，層粘連蛋白及IV型膠原減少，肺透明質酸減少，硫酸肝素糖蛋白增多，提示肺老化不僅是肺細胞的衰老，肺細胞外基質(ECM)也發生了相應改變。

MMPs是一組具有相同功能、結構高度同源、依賴鋅離子的內肽酶的總稱，主要作用是降解ECM和基底膜［6］。TIMPs是 MMPs的天然特異性抑制因子，MMPs－TIMPs平衡在協調 ECM成分的合成與降解過程，維持ECM內環境的穩定和結構完整中發揮重要作用。明膠酶是MMPs家族成員之一，包括明膠酶 A(MMP－2)和明膠酶 B(MMP－9)兩種成員，明膠酶的底物包括明膠、IV、V、VII、X型膠原和纖連蛋白，在體內明膠酶可高效降解基底膜的主要結構成分 IV 型膠原［7－8］。MMP－9 主要在巨噬細胞和中性粒細胞表達，在成纖維細胞、支氣管黏膜上皮細胞和肺泡上皮細胞中也有少量表達;MMP－2主要在巨噬細胞表達，此外在成纖維細胞、支氣管粘膜上皮細胞和肺泡上皮細胞以及基質中也有一定的表達［9］。明膠酶及其抑制物表達失衡是引起ECM異常積聚的重要因素之一［10－11］。

有實驗研究對不同周齡(4周齡和9周齡)大鼠不同組織中的明膠酶活性進行了檢測，結果表明，大鼠心、肺、肝、腎、主動脈中以明膠酶B為主，低齡大鼠(4周齡)各組織中的明膠酶活性均高于高齡大鼠(9周齡)的相應組織，這可能與前者膠原代謝速度較快有關［8］。本研究結果顯示，大鼠肺組織中明膠酶MMP－2和 MMP－9均隨著月齡的增長呈先降后升波谷型曲線變化;3月齡、12月齡和18月齡MMP－2和MMP－9均較1月齡明顯下降，且以12月齡為最低值;該結果與上述實驗研究中低齡大鼠(4周齡)肺組織中的明膠酶活性均高于高齡大鼠(9周齡)肺組織的結果相一致。

有研究表明［1］，隨年齡增長，肺泡上皮基底膜逐漸增厚，尤以老年階段明顯;老年大鼠肺基底膜Ⅳ型膠原和層粘連蛋白減少。結合本實驗結果24月齡老年大鼠肺組織中 MMP－2和 MMP－9均高于低齡大鼠，推測老年大鼠肺基底膜IV型膠原和層粘連蛋白減少，可能與 MMP－2和 MMP－9在老年大鼠肺組織中增高，降解肺基底膜IV型膠原和層粘連蛋白增多有關。邱忠民等［12］的研究發現老年大鼠肺泡Ⅱ型細胞基底膜也增厚，提示老年大鼠肺泡II型細胞對基底膜ECM代謝能力發生了改變，致使肺泡上皮基底膜ECM出現過度堆積;老年大鼠肺泡上皮基底膜層粘連蛋白含量下降，纖維連接蛋白增多，導致肺泡修復能力的異常，致使修復不及時或不完全，參與老年肺形態結構和功能改變的形成。

Thrailkill［13］對 189 名 2～18 歲的兒童及青少年血清MMP－2進行檢測，結果表明與年齡呈負相關，與本實驗中3月齡大鼠肺組織中 MMP－2均較1月齡明顯下降的結果相一致。新近有研究顯示［14］，正常人血清MMP－2水平在20～29歲較高，30～39歲有所下降，40～69歲后隨年齡的增加而升高，到70～80歲下降，此結果與本研究大鼠肺組織中MMP－2隨月齡變化的規律相似，但血清中MMP－2水平是否與肺組織中MMP－2的表達相關需進一步研究證實。

TIMP－1具有多種生物學功能，能特異性與MMP－2、MMP－9催化活化中心的鋅離子結合，而封閉其催化中心，從而使 MMP－2、MMP－9失去降解 ECM 的活性。本研究結果顯示，大鼠肺組織中TIMP－1隨著月齡的增長呈先降后升波谷型曲線變化;3月齡、12月齡和18月齡TIMP－1均較1月齡明顯下降，且以12月齡為最低值;24月齡TIMP－1較3月齡、12月齡和18月齡明顯上升。大鼠肺組織中TIMP－1增齡性變化的機制仍不清楚，尚需進一步研究。

正常情況下，MMP－2 及 MMP－9 分別與 TIMP－1是以1∶1的比例一起釋放的，二者之間的平衡保持了正?；|和內環境的穩定。MMP－2和 MMP－9可降解IV型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，而TIMP－1 可抑制 MMP－2 和 MMP－9，從而抑制基質降解，引起基質沉積。MMP－2、MMP－9 增多，使降解細胞外基質增多，且 TIMP－1反饋性增多，以避免組織破壞過度。同時高濃度的 TIMP－1能促進 ECM沉積，導致異常的膠原修復。本實驗結果顯示:MMP－2/TIMP－1、MMP－9/TIMP－1 隨著月齡的增長呈先升后降波峰型曲線改變，12月齡和18月齡均較1月齡明顯升高，且以18月齡為最高點。老齡大鼠肺組織中 MMP－2/TIMP－1、MMP－9/TIMP－1 隨著月齡的增加而變化的確切原因有待深入研究。

本研究探討了大鼠肺組織中MMPs、TIMPs增齡性變化的規律，可以得出以下結論:⑴ 大鼠肺組織中 MMP－2、MMP－9 和 TIMP－1 均隨著月齡的增加呈先降后升波谷型曲線變化;⑵ MMP－2/TIMP－1及MMP－9/TIMP－1比值均隨著月齡的增加呈先升后降波峰型曲線變化;⑶ 大鼠肺組織中MMPs及其抑制劑TIMPs隨月齡的增長，呈特征性變化規律。

［1］劉新民，何冰.大鼠肺細胞外基質老化的實驗研究［J］.中華老年醫學雜志，1996，15(3):170－172.

［2］孫曉明，尹格平.實體瘤組織細胞粘附分子流式細胞研究方法的建立［J］.中華醫學檢驗雜志，1997，20(1):9－11.

［3］宋平根，李素文.流式細胞術的原理和應用［M］.北京:北京師范大學出版社.1992:64－139.

［4］黃念秋，吳善.現代老年呼吸病學［M］.北京:人民軍醫出版社.1998:1－9.

［5］王蓉，唐玉，張麗.大鼠海馬神經元突觸超微結構的增齡變化［J］.中國比較醫學雜志，2009，19(4):18－22.

［6］Maskos K，Bode W.Structural basis of matrix met alloproteinases and tissue inhibitors of met alloproteinases［J］.Mol Biotechnol，2003，25(3):241－266.

［7］Chakrabarti S，Patel KD.Matrix met alloproteinase－2(MMP－2)and MMP－9 in pulmonary pathology［J］.Exp Lung Res，2005，31(6):599－621.

［8］孫紅霞，溫進坤，韓梅.大鼠不同年齡和組織中明膠酶活性的比較研究［J］.河北醫科大學學報，1998，6:350－351.

［9］Segura－Valdez L，Pardo A，Gaxiola M， et al. Upregulation of gelatinases A and B， collagenases 1 and 2， and increased parenchymal cell death in COPD［J］. Chest，2000，117:684－694.

［10］Lenz O， Elliot SJ， Stetler－Stevenson WG. Matrix met alloproteinases in renal development and disease［J］. J AmSoc Nephrol，2000，11(3):574－581.

［11］Kim H，Oda T，Lopez－Guisa J，et al.TIMP－1 deficiency does not attenuate interstitial fibrosis in obstructive nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2001，12(4):736－748.

［12］邱忠民，何冰，宋明臣，等.老年大鼠肺泡II型細胞細胞外基質成分和基底膜厚度的變化［J］.北京醫科大學學報，2000，32(6):555－566.

［13］Thrailkill KM，Moreau CS，Cockrell G，et al.Physiological matrix met alloproteinase concentrations in serum during childhood and adolescence，using Luminex Multiplex technology［J］.Clin Chem Lab Med，2005，43(12):1392－1399.

［14］張紅，羅湘杭，謝輝，等.基質金屬蛋白酶－1、－2與女性年齡、骨轉換生化指標及骨密度的關系［J］.中華內科雜志，2006，45(4):306－309.

Changes of MMP-2，MMP-9 and TIMP-1 Expression in the Lung Tissue of Rats with Increasing Age

LI Xiao－ying1，WANG Rong2，NIE Xiu－hong1，LI Lin2，CHANG Yi1，ZHAO Song－lin1，WAN Sui－gui3，SUN Xue－mei3，XU Juan3
(1.Department of Respiration Medicine;2.Central Laboratory，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，and Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of the Ministry of Education;3.Flow Cytometry Laboratory，Department of Hematology，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China)

Objective To investigate the changes of matrix met alloproteinases(MMPs)－2，－9 and tissue inhibitors of met alloproteinases(TIMP－1)in the lung tissue of rats with increasing age.Methods 47 male SD rats were assigned into five groups at different ages.Tissue samples were taken from the lower right lobe of the lung.Unicellular suspension was prepared for detection of MMP－2，MMP－9 and TIMP－1 by flow cytometry(FCM).Results The expressions of MMP－2，MMP－9 and TIMP－1 in the rats of 3－month，12－month and 18－month groups were significantly decreased compared withthat in the 1－month group.Those in 24－month group showed slightly higher than that of 1－month group，but with no significant difference between these two groups.The ratios of MMP－2/TIMP－1 and MMP－9/TIMP－1 in the 12－month and 18－month groups were significantly higher than that of 1－month group，while the ratios in 3－month and 24－month groups were slightly higher than that in the 1－month group.Conclusions MMPs and TIMPs in lung tissue of rats show characteristic changes with aging.

Matrix met alloproteinase;Tissue inhibitorofmet alloproteinase;Ratlung;Increasing age;Flow cytometry

R－33

A

1671－7856(2010)08－0010－05

2010－04－08

國家重點基礎研究計劃－973計劃項目(2003CB517104)。

李小瑩(1963－)，女，碩士，副主任醫師。

聶秀紅(1963－)，女，博士，主任醫師，教授，研究方向:肺老化機制研究，電話:010－83198668，E－mail:xwyyhxk@126.com。