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酸法脫酰胺大米蛋白/葡聚糖體系微結構性質研究

2010-11-04 13:55劉永樂李向紅易翠平華欲飛周素梅
中國糧油學報 2010年10期
關鍵詞:葡聚糖酰胺凝膠

劉永樂李向紅易翠平華欲飛周素梅

(長沙理工大學食品科學省級重點學科預備學科1,長沙 410114)

(江南大學食品學院食品科學與技術國家重點實驗室2,無錫 214122)

(中國農業科學院農產品加工研究所3,北京 100094)

酸法脫酰胺大米蛋白/葡聚糖體系微結構性質研究

劉永樂1李向紅1易翠平1華欲飛2周素梅3

(長沙理工大學食品科學省級重點學科預備學科1,長沙 410114)

(江南大學食品學院食品科學與技術國家重點實驗室2,無錫 214122)

(中國農業科學院農產品加工研究所3,北京 100094)

研究了酸法脫酰胺大米蛋白(ADRP)/葡聚糖混合體系的微觀結構及流變性質。采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察了ADRP/葡聚糖混合體系的微觀結構,結果顯示出ADRP之間產生了有效的交聯,并且在蛋白質質量分數較高的混合體系中形成了蛋白質網狀結構。流變儀觀察了混合體系的動力學性質,黏度 -剪切速率曲線表明蛋白質交聯程度較高的體系黏度增加明顯,頻率掃描結果進一步證實蛋白質質量分數較高的體系凝膠網絡結構的形成;質構儀測試了此凝膠體系的強度,證實混合體系凝膠比單一ADRP的蛋白凝膠具有更高的破裂強度。ADRP和葡聚糖的相分離是混合體系中蛋白質網絡結構形成的可能原因。

大米蛋白 酸法脫酰胺 微觀結構 流變性質

目前,對相對廉價蛋白質資源的開發并提升其產品附加值的需求逐漸上升,越來越多的研究圍繞著對不同植物蛋白資源的提取、表征及應用[1-3]。大米是世界上最重要的糧食資源之一,世界上 50%以上的人口以大米為主食,是大部分人口的能量及蛋白質來源[4]。大米中含蛋白質為 8%~13%[5],研究發現大米蛋白是谷物蛋白中營養價值較高的一種,具有無色、味道溫和、必需氨基酸含量豐富、低過敏性及低膽固醇等特點[6],因此對大米蛋白的提取,特別是對碎米及大米淀粉副產物中大米蛋白的提取,可以顯著提高其產品附加值;如果得到的蛋白產品具有較好的功能性質則更有利于其在食品加工中的應用。

大多數關于大米蛋白的文獻都集中于研究大米蛋白的分離及表征[7-9],而對其應用的研究則很少。由于大米蛋白的低溶解度導致其在液態食品及飲料中的應用受到限制,低溶解度也會影響到蛋白的其他功能性質例如起泡性、乳化性及凝膠性等[10]。造成其低溶解度的主要原因是蛋白質中高含量的谷氨酰胺及天冬酰胺之間通過氫鍵等結合使蛋白質聚集沉淀,研究表明通過對蛋白質脫酰胺能改善其溶解度及其他功能性質[11],即使較低的脫酰胺度也可以導致蛋白質功能性質的顯著改善[12]。已有研究發現(酸法和酶法)脫酰胺能顯著改善小麥面筋蛋白、玉米醇溶蛋白等的溶解性[12-14]。易翠平等[15]采用酸法對大米蛋白脫酰胺也顯著改善了其溶解度。

限制大米蛋白應用的另一方面原因是其凝膠后不能形成黏彈性網絡結構[16],而黏彈性網絡結構的形成對凝膠狀食品及焙烤食品 (例如無面筋蛋白產品)的穩定性具有極其關鍵的作用[17]。一些食品科學家利用蛋白質和多糖的相互作用獲得這種網絡狀結構,因為這兩種生物分子間的相互作用對產品的宏觀性質例如流動性、穩定性、質構及口感具有重要影響[18],通過合適的控制其相互作用可以設計出具有良好結構和質構的產品[19]。

本研究構造了酸法脫酰胺大米蛋白(ADRP)/葡聚糖的混合體系,表征了ADRP的分子結構,觀察了混合體系的微觀結構和動力學性質,以期改善大米蛋白的性質并拓寬其應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碎米樣品 (精白米副產物)由湖南金健米業提供,其含蛋白質為 7.8%(N×5.95,干基);葡聚糖、異硫氰酸酯(FITC)和氨試劑盒:Sigma公司。所有其他化學試劑均為分析純。

TGL-16B高速臺式離心機:上海安亭科學儀器廠;0.45μm醋酸纖維膜:德國Merck公司;ZETA-SIZER2000型 zeta電位儀:英國 Malvern公司;Agi2 lent1100高效液相色譜儀:美國安捷倫公司;TSK gel2000 S WXL柱:日本 TOSOH公司;Shodex K W804蛋白柱:日本 Shodex公司;Leica TCS 4D共聚焦激光掃描顯微鏡:德國 Leica Lasertechnik GmbH公司; AR1000流變儀:美國 TA公司;TA-XT Plus質構儀:英國 StableMicro Systems公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大米粉的脫脂

大米粉采用正己烷在常溫下 (25℃)浸提攪拌1 h,料液比為 1∶5,漿液真空過濾后濾餅在室溫下自然干燥 48 h。干燥后的原料經碾磨后過 200目篩, 4℃下保藏。

1.2.2 酸法脫酰胺大米蛋白(ADRP)的制備

大米蛋白的提取工藝是在 Agboola等[20]的基礎上進行了適當的改進。脫脂米粉按1∶5的料液比加入 0.05 mmol/L的NaOH溶液浸提,室溫下攪拌 1 h,以10 000 r/min離心 30 min,棄去沉淀。上清液用2 mol/L的HCl溶液調節 pH值至 4.1~4.8,以10 000 r/min離心 30 min,棄去上清液,得到的蛋白質凝乳經水洗后冷凍干燥并在 4℃條件下保存。部分蛋白樣品采用 0.38 mol/L的 HCl在 88.5℃反應3.5 h后迅速用冰浴冷卻,冷卻后的溶液用 2 mol/L的NaOH溶液調節至 pH 7.0,4℃透析 24 h后冷凍干燥。樣品的脫酰胺度為脫酰胺之后釋放的氨含量除以樣品中總的酰胺氮含量,其中脫酰胺之后樣品釋放的氨含量用氨試劑盒檢測,總酰胺氮含量是通過檢測初始大米蛋白樣品用 3 mol/L的 HCl在 110℃處理 3 h后釋放的氨含量獲得[15]。

采用本試驗中的脫酰胺條件獲得的ADRP其脫酰胺度達到 49.76%,溶解度增加至81.24%,而蛋白質水解度僅為 9.12%(甲醛滴定法測得)。

1.2.3 混合體系的制備

ADRP粉末分散于去離子水中使其質量分數為20%并磁力攪拌 1 h,分散溶液在 10 000 r/min離心15 min后上清液過 0.45μm的醋酸纖維素膜以除去任何不溶性物質,采用 zeta電位儀和體積排阻色譜(SEC-HPLC)表征 ADRP和初始大米蛋白的分子結構。

制備葡聚糖溶液時直接將葡聚糖粉末(Mw 2000 ku)分散于去離子水中,在室溫下攪拌 1 h,pH值調至 7.0后過 0.45μm的醋酸纖維素膜以除去任何不溶性物質。

ADRP/葡聚糖混合體系的制備是將不同質量分數配比的ADRP/葡聚糖混合體系 (蛋白質質量分數1%~6%,多糖質量分數 1%~3%,離子濃度 0.5 mol/L)充分攪拌 1 h后置于具塞試管中,加入疊氮鈉以防止微生物的生長,將具塞試管密封后放置在25℃的水浴中 24 h。凝膠的形成是通過直接觀察混合體系得到,一種混合體系轉變成固態時被認為形成了凝膠[21]。

1.2.4 Zeta電位及分子質量分布分析

ADRP及初始大米蛋白樣品的 zeta電位由 zeta電位儀測得,5次測定的平均值報告為 zeta電位。

蛋白樣品的分子質量分布由 SEC-HPLC測得, ADRP使用 TSK gel2000S WXL柱,流動相為50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0);由于初始大米蛋白樣品的分子質量較大,因此采用 Shodex K W-804蛋白柱分析初始大米蛋白樣品的分子質量分布,流動相為 3.5%的 SDS,因為初始大米蛋白不溶于50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0)中,檢測中洗脫速率均為 1 mL/min,洗脫液在 220 nm處檢測,柱溫為25℃。

1.2.5 混合體系微觀結構觀察

在顯微觀察前,先用溶于二甲基亞砜中的 2%的FITC對蛋白質進行標記,標記量是每 100 mL蛋白溶液加入 25μL的 FITC并用磁力攪拌器攪拌90 min[22]?;旌衔锏呐渲剖菍?ADRP與葡聚糖混合,配制成蛋白質質量分數 1%、4.5%和 6%、多糖質量分數 3%的混合物。取少量混合物滴在載玻片上,并用蓋玻片小心密封,以防氣泡產生。制好的玻片用CLS M觀察,Ar/Kr激光發生器發射波長確定為485 nm。

1.2.6 體系流變性質的測定

將配制好的樣品加于流變儀底部平板上,選擇直徑 40 mm、0°的平板并設定狹縫距離為 1 mm,讓板間完全充滿樣品,平板頂部涂上一薄層硅油以防止樣品水分蒸發,測定溫度恒定為(25±0.1)℃。

黏度 -剪切速率:固定應變 1%,剪切速率為0到100 s-1,測定整個過程樣品的黏度隨頻率的變化曲線。將單一葡聚糖溶液(3%)、單一的ADRP溶液(6%,離子濃度 0.5 mol/L)及混合物(蛋白質質量分數1%、4.5%、6%,多糖質量分數 3%,離子濃度 0.5 mol/L)攪拌均勻后以 1 000 r/min離心 5 min去除存在的氣泡后進行分析。

應變掃描:固定頻率 1 Hz,應變從 0.1%到10%,測定隨著應變的變化,混合物 (蛋白質質量分數1%、4.5%、6%,多糖質量分數 3%以及離子濃度0.5 mol/L)動態模量 (G′,儲能模量;G″,損耗模量)等參數的變化獲得各體系的線性黏彈性范圍。

頻率掃描:固定應變 0.5%,掃描頻率從 0.1到100 Hz,測定體系中 G′和 G″的變化。

1.2.7 混合體系質構性質的測定

用質構儀測定混合物凝膠 (蛋白質質量分數6%,多糖質量分數 3%,離子濃度 0.5 mol/L)及單一ADRP凝膠(蛋白質質量分數 18.5%,離子濃度 0.5 mol/L)的強度,選用直徑為 10 mm的圓柱狀平頭探頭,設定前進速度:2 mm/s,沖壓速度:1 mm/s;后撤速度:2 mm/s,沖壓深度:10 mm;制備 3個平行樣品,重復測定過程取平均值得到凝膠質構參數。

2 結果與分析

2.1 ADRP的表征結果

Wu等[13]及 Chan等[23]分別研究發現酸溶解的小麥面筋蛋白及酸法脫酰胺的大豆蛋白的分子質量和表面電位與其功能性質相關,同時也影響到蛋白質和多糖混合體系的性質。

初始大米蛋白樣品的 zeta電位是 (-29.5±2.5) mV,本研究條件下獲得的ADRP(脫酰胺度49.76%)其zeta電位增加至 (-43.8±1.6)mV,溶解度增加至81.24%。脫酰胺使得谷氨酰胺和天冬酰胺中的酰胺基轉變成羧基,這種羧化作用減少了分子內氫鍵,分子上負電荷增加,靜電排斥作用增強,從而導致了脫酰胺蛋白質溶解度的增加[12]。

初始大米蛋白樣品及ADRP在220 nm下的分子質量分布曲線見圖 1。初始大米蛋白樣品的 SECHPLC曲線(圖 1a)表明樣品中有大約 71.23%的蛋白質分子其分子質量大于 1 000 ku,這一部分對應于谷蛋白中高分子質量聚集體部分;另外超過 20%的部分分子質量約為 19.8 ku,由低分子質量部分組成,包括清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白[9]。ADRP的結果 (圖 1b)表明樣品中主要由分子質量為 20.14和 10.882 ku的分子組成,其總含量達到 91.58%。從 SEC-HPLC的分析結果可知,大米蛋白的酸法脫酰胺以及肽鍵的輕度水解導致了蛋白質分子的解聚,溶解度增加。

圖1 初始大米蛋白及ADRP的分子質量分布

2.2 混合體系的微觀結構

ADRP/葡聚糖混合體系的 CLS M圖見圖 2。圖2a為蛋白質質量分數 1%與葡聚糖質量分數 3%混合后形成的均相體系的微觀結構,圖中白色區域代表 FITC標記的區域,熒光區域均勻的分布在整個體系中;而蛋白質量分數為 4.5%及 6%,多糖質量分數為 3%的混合體系的 CLS M圖 (圖 2b和圖 2c)中,蛋白富集區域在圖中清晰可見,黑色區域即為多糖所在的區域,兩種生物大分子組分分布在分開的兩相中。其 CLS M圖也揭示了混合體系中蛋白質組分的相互交聯,蛋白質質量分數增加,交聯程度更加顯著,在蛋白質質量分數為 6%的混合體系中,蛋白質組分相互交聯形成了網絡狀結構,在宏觀下觀察時,此混合物在如此低的蛋白質質量分數下轉變成了均勻黏稠的凝膠。由于葡聚糖不能形成凝膠,大米蛋白不能構成黏彈性網狀結構,因此可能的原因是系統中葡聚糖的存在使得葡聚糖相截留了大量的水分,導致蛋白質相的濃縮;同時伴隨著凝膠的形成,聚合物構象的改變使得溶劑在兩相間重新分配[24]。Morris等[25]及 Mounsey等[26]認為是一種排除效應導致了每一組分的有效質量分數增加,以致多維結構的凝膠形成;他們同時指出這是一種被“捕獲”了的相分離,即達到宏觀相分離之前,整個體系已經轉變成微相分離的凝膠,而這種微相分離的結構也是構成食品質構的基礎。在實際食品結構的構造中,例如色拉調味料的生產時,可以利用這種機理生產出具有獨特連續性質構的產品[27]。

圖 2 ADRP/葡聚糖混合體系(離子濃度 0.5 mol/L)的CLS M圖像

2.3 流變性質

2.3.1 剪切速率 -黏度曲線

圖 3是ADRP、葡聚糖及其混合體系的黏度/剪切速率變化曲線,混合體系包含了均相區域的體系及相分離體系。所有的體系在較大的剪切速率范圍內,顯示剪切變稀的性質,即假塑性流體。體系之所以呈現假塑性是因為分子定向排列(在外力作用下,分子從無序到有序移動);葡聚糖溶液這種高分子溶液也屬于假塑性流體。對混合體系來說,隨著 ADRP質量分數的增加,流變行為雖然相似,但是,體系的黏度值增加;由于 1%ADRP/3%葡聚糖混合物是均相體系,因此呈現出較小的黏度值,而其他兩種混合物其黏度值明顯增加,這是因為組成混合物連續相的生物大分子組分受到相分離的影響而使得黏度值增加,相分離表現出對黏度值的增效性[28]。

圖 3 單一ADRP(6%、離子濃度 0.5 mol/L)、葡聚糖(3%)及ADRP/葡聚糖混合體系的剪切速率 -黏度曲線

2.3.2 應變掃描

圖 4a和圖 4b是流變儀測得的 ADRP/葡聚糖混合物(蛋白質質量分數分別為 1%、4.5%和 6%,多糖質量分數 3%,離子濃度 0.5 mol/L)隨著應變的變化,動態模量 (G′,G″)的變化情況。從圖 4中可以看出,應變小于 1%時,三種混合物的 G′和 G″值均基本保持恒定,表現出與應變無關;隨著應變值進一步增加時,兩者逐漸降低。因此,對所有混合體系來說,其線性黏彈性區域為應變值小于 1%的范圍內,在本研究后續的頻率掃描時設定應變值為0.5%。

圖 4 ADRP/葡聚糖混合體系(離子濃度 0.5 mol/L)的應變掃描結果

2.3.3 頻率掃描

采用頻率掃描來進一步表征混合體系是否形成凝膠(圖 5)。對于一種典型的凝膠來說,在整個頻率范圍內,G′和 G″值表現出與頻率無關,且 G′值始終大于 G″[28]。從圖 5可以看出,6%ADRP/葡聚糖混合體系的 G′和 G″曲線相互平行且 G′>G″,在頻率從0.1變化到 100 Hz時,G′和 G″的值基本上不隨頻率的變化而變化,進一步說明體系形成了凝膠;而 1%ADRP/葡聚糖混合體系,其 G′值始終小于 G″,體系表現出流體性質;4.5%ADRP/葡聚糖混合體系的 G′和 G″的曲線發生交叉,表明該樣品中蛋白質的交聯很弱,處于半流體狀態,當振蕩頻率低時可以響應而流動,呈現液體性質,而振蕩頻率高時,由于蛋白質體系的遲滯阻力表現出抗力,呈現固體性質,與 CLS M觀察結果一致。

研究中發現,對于單一的ADRP來說,pH值 6.5~8.0的范圍內,蛋白質質量分數需要達到 16.5%~20%體系才能形成凝膠。而構造的ADRP/葡聚糖混合體系在如此低的蛋白質質量分數下就可以形成凝膠,對拓寬其在實際食品中的應用具有一定的意義。

圖 5 ADRP/葡聚糖混合體系(離子濃度 0.5 mol/L)的頻率掃描結果

2.4 質構性質

表1列出了ADRP凝膠(蛋白質質量分數18.5%,離子濃度0.5 mol/L)和 6%ADRP/葡聚糖混合體系的質構性質,盡管后者的蛋白質質量分數遠低于前者,其凝膠硬度和黏著性反而更高,其質構性質的差異也表明了體系微觀結構的差異,前者沒有形成蛋白質的網絡結構是其硬度和黏著性更低的原因。

表1 ADRP和ADRP/葡聚糖凝膠體系的質構性質分析

3 結論

研究了ADRP和葡聚糖混合體系的微觀結構和流變性質,大米蛋白的脫酰胺使得蛋白分子 zeta電位的增加和分子質量的下降,導致蛋白質溶解度的增加。CLS M觀察到混合體系中 ADRP之間的有效交聯,蛋白質質量分數較高時形成了蛋白質的網絡結構;黏度 -剪切速率曲線表明蛋白質交聯程度較高的體系黏度增加明顯,頻率掃描結果進一步證實此體系凝膠結構的形成;質構儀測試了此凝膠體系的強度,證實混合體系凝膠比單一ADRP的蛋白凝膠具有更高的破裂強度。ADRP和葡聚糖的相分離和/或溶劑在兩相間的重新分布是混合體系中蛋白質粘彈性網絡結構形成的可能原因。

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Microstructure Properties ofMixtures of Acid-Deamidated Rice Protein and Dextran

Liu Yongle1Li Xianghong1Yi Cuiping1Hua Yufei2Zhou Sumei3
(Pre-Key Subject of Food Science,Changsha University of Science&Technology1,Changsha 410114)
(State KeyLaboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology, Jiangnan University2,Wuxi 214122)
(Institute ofAgro-Food Science and technology,The Chinese Academy ofAgricultural Sciences3,Beijing 100094)

The microstructure and rheological properties ofmixtures of acid-deamidated rice protein(ADRP) and dextran were studied.The microstructuresofwere described using confocal laser scanningmicroscopy(CLS M).It is revealed in results that effective association occurs between ADRPs and a protein net work-like structure is formed in the mixture with higher protein concentration.Mechanical properties of the mixtures were observed by rheometer.The steady shearmeasurements show a correlation of the CLS M results via a marked increase in the viscosity of the mixtureswith protein association.Frequency sweeps furtherprove the build-up of the gelled network-like structure. The differences in fracture forces observed by texturalmeasurements between mixture and single ADRP gel also sug2 gest the difference in microstructures.The for mation of the network-like structure appears to have occurred through a phase separation ofADRP and dextran.

rice protein,acid-deamidation,microstructure,rheology

TS201.2+1 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)10-0001-07

863計劃(2008AA100801)

2009-10-20

劉永樂,男,1962年出生,教授,博士,農產品深加工及食品生物技術

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