脫脂乳的乳酸菌發酵和酶解產物對小鼠脾淋巴細胞增殖影響的比較

馮芳菲，郭 鸰，*，李繼昌

（1.東北農業大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030；2.東北農業大學動物醫學學院藥理與毒理教研室，黑龍江哈爾濱150030）

脫脂乳的乳酸菌發酵和酶解產物對小鼠脾淋巴細胞增殖影響的比較

馮芳菲1，郭 鸰1，*，李繼昌2

（1.東北農業大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030；2.東北農業大學動物醫學學院藥理與毒理教研室，黑龍江哈爾濱150030）

為探討脫脂乳乳酸菌發酵產物和堿性蛋白酶水解產物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，采用凝膠過濾法將各發酵和水解產物進行分離純化，測定不同處理方法和不同分子量范圍的肽段對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的差別。結果顯示，經乳酸菌發酵或酶水解后的脫脂乳蛋白，尤其是分子量范圍＜3kDa的小肽具有較強的免疫調節活性。因此，發酵或水解用于開發低致敏乳源蛋白基料是可行的。

發酵，酶解，脾淋巴細胞增殖

食物過敏是一種變態反應，是由于對食物或食物組分的過敏引起的，代表一種重要的健康問題。尤其在發達的工業化國家，據估計在發達國家中大約有1%～2%的成年人發生食物過敏，而在低于3歲的兒童中這一數字達到8%［1］。牛乳過敏（CMA）是嬰兒和兒童中最常見的一種食物過敏，其在1歲左右嬰兒對牛乳過敏的比例大約為2%～3%［2-4］，因此研究牛乳過敏是非常有必要的。生產低致敏乳源蛋白基料目前為乳品領域的研究熱點。研究顯示，低致敏乳源蛋白基料的制備主要有兩種途徑：乳酸菌發酵或經酶水解。其中乳酸菌及其發酵產物調節免疫應答的能力已在動物疾病模型中得到了深入的研究［5］。已有實驗表明在人體和動物研究中，通過食物攝入乳酸菌或酸奶，可提高自然殺傷性細胞活性和T細胞功能。此外牛乳蛋白水解產物可以激活宿主免疫系統，促進體內免疫球蛋白的生成，特別是激活巨噬細胞和T淋巴細胞［6-7］。以脫脂乳為原料，采用乳酸菌發酵和蛋白酶水解方法進行處理。本實驗采用實驗室保存鼠李糖乳酸桿菌MH22 16S（Lactobacillus rhamnosus strain MH22 16S，簡稱LR）和實驗室保存菌株（簡稱L14）發酵脫脂乳以及采用堿性蛋白酶（alkaline proteinase，簡稱AP）水解脫脂乳。脫脂乳經酶解和發酵所得不同產物對免疫性的影響是非常值得探討的問題。因此，在比較脫脂乳乳酸菌發酵產物和蛋白酶水解產物對小鼠免疫細胞功能的基礎上，也比較了其不同分子量的分離組分的免疫調節活性，為將酶解和發酵作為進行生產低致敏乳源蛋白基料的方法提供有力依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 實驗室保存已經證明具有低致敏性的鼠李糖乳酸桿菌 MH22 16S（Lactobacillus rhamnosus strain MH22 16S，LR）；對照菌株 實驗室保存菌株（編號L14）；堿性蛋白酶（alkaline proteinase，AP）；脫脂乳粉 黑龍江飛鶴乳業有限公司；MTT Amresco；BCA試劑盒 beyotime；RPMI-1640 HyClone；胎牛血清 solarbio；青鏈霉素、ConA sigma；96孔板Costar；superdex-75預裝柱 AKTA；sephadex G-10 pharmacia；雄性健康Balb/c小鼠 6周齡，體質量16～18g，購自哈爾濱腫瘤醫院實驗動物中心。

DHP-9272恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；LGJ-1冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠；低溫冷凍離心機 上海離心機械研究所；AKTA分離純化儀 Amersham Biosciences公司；倒置顯微鏡 奧林巴斯光學工業株式公社；酶標儀Model 680 美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理 實驗樣品分為3組：LR菌株組、L14菌株組及AP組。將LR菌株、L14菌株經MRS培養基活化后，接種10%滅菌脫脂乳，適宜溫度培養48h；堿性蛋白酶水解脫脂乳1.5h，50min后沸水浴滅活。所得樣品分別以3000r/min，15min離心，上清為可溶性小分子量肽段。將小肽通過superdex-75凝膠柱，根據標準樣品可分離純化收集得到不同分子量范圍（＞5kDa，3～5kDa及＜3kDa）的肽段，再將收集所得的肽段通過sephadex G-10凝膠柱脫鹽處理，再經凍干以備后續實驗。

1.2.2 BCA試劑盒測定樣品的蛋白濃度 參考說明書。

1.2.3 脾細胞制備及增殖測定 提取BALB/C小鼠脾淋巴細胞，用pH7.0的完全RPMI-1640培養液（包含10%胎牛血清和0.1%青鏈霉素）調整細胞密度為2×106/mL，加入96孔板90μL/孔，實驗孔加入除菌的脫脂乳（skimmed milk，簡稱SM）、LR、L14、AP和不同濃度的小肽10μL/孔（終濃度50～2000μg/mL），相同樣品分為加ConA 10μL/孔（終濃度為5μg/mL）刺激組和不加ConA刺激組（以培養液補足體積差）。陰性對照為脾細胞加培養液，空白孔為完全培養液。各孔均設3個重復孔。培養48h后加入MTT（5mg/mL）20μL/孔。繼續培養4h后，加入三聯液（10%SDS，5%異丁醇，0.012mol/L HCl，雙蒸水溶解）100μL/孔，過夜。酶標儀570nm測定OD值［8］。結果計算按下式：

2 結果與分析

2.1 可溶性小肽分離純化結果

所得的三種可溶性小肽，通過superdex-75凝膠柱，根據標準樣品分子量大小，可收集得到不同分子量范圍（ ＞5kDa，3～5kDa，＜3kDa）的小肽。（如圖1～圖3所示）。

由分離純化的出峰圖譜看出，不同方法處理脫脂乳所得到的小肽，分子量及其含量均不相同（表1）。

圖1 LR菌株發酵脫脂乳游離小肽分離純化圖

圖2 L14菌株發酵脫脂乳游離小肽分離純化圖

圖3 AP水解脫脂乳游離小肽分離純化圖

表1 各產物不同分子量峰面積（MWt）分布比例（%）

2.2 分離純化產物蛋白濃度的確定

采用發酵或水解脫脂乳生產的乳蛋白，殘余抗原活性降低，而且乳蛋白本身被水解，得到的蛋白質水解物是由分子量大小不等的肽段所組成的混合物，此外，產品中還含有少量無機鹽、游離氨基酸等成分。采用BCA試劑盒可測定不同處理方法下分子量組分的蛋白濃度。以吸光值（A）為縱坐標，酪蛋白濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線（圖4）。

圖4 BCA濃度與吸光值關系的標準曲線

其中 A與 C的關系為：A=0.7821C+0.0838（μg/mL），R2=0.9957。

根據標準曲線計算凍干樣品中蛋白的濃度，并根據需要的濃度進行配制。

表2 不同分子量范圍的LR、L14和AP對靜息期小鼠脾T淋巴細胞增殖能力的影響

表3 不同分子量范圍的LR、L14和AP對受ConA刺激下小鼠脾T淋巴細胞增殖能力的影響

2.3 SM、LR、L14、AP組對小鼠脾T淋巴細胞增殖活性的影響

SM、LR、L14和AP組分別測定了未受ConA刺激（圖5A）和受ConA刺激（圖5B）后，對小鼠脾淋巴細胞增殖影響，該增殖水平以SI（刺激指數）表示。結果表明該4組均刺激靜息細胞，并且刺激指數與濃度呈正比關系，當濃度達到2000μg/mL時SI最高。當SM、LR、L14和AP組濃度分別達到500、200、500、200μg/mL時，差異顯著（p＜0.05）。SM組較LR組、L14組和AP組的刺激指數低，顯示發酵或水解脫脂乳釋放出的小肽能夠更大地刺激脾淋巴細胞增殖。達到最高濃度（2000μg/mL）時，SM組、LR組、L14組和 AP組的 SI分別為 1.74、2.24、1.97、2.04。在相同的濃度下，LR組SI值高于另外三組，當受ConA刺激時，SM組脾細胞明顯因濃度增高（1000～2000μg/mL）而受到抑制，然而，靜息期SM組在高濃度（1000～2000μg/mL）仍呈刺激作用。當受ConA刺激時，LR組的濃度達到1000μg/mL時，脾細胞SI差異顯著，然而靜息期的細胞則在LR達到200μg/mL時，即表現為差異顯著。Diane Saint-Sauveur（2004）［9］實驗結果顯示，乳清分離蛋白（WPI）抑制受ConA刺激的脾細胞的增殖作用，與本實驗SM組（2000μg/mL）一致。并且WPI的酶解產物（ED）對靜息期與受ConA刺激的脾細胞均呈增殖作用，與本實驗中LR、L14、AP組實驗結果一致。

2.4 不同分子量范圍的LR、L14和AP對小鼠脾T淋巴細胞增殖能力的影響

由LR，L14和AP制備的三部分不同分子量的肽段對小鼠脾細胞的作用同樣分為靜息期組（表2）和受ConA刺激組（表3）。靜息期小鼠脾細胞顯著受到三部分肽段的刺激，并與濃度呈一定的正比關系（50～2000μg/mL）。在LR、L14和AP的三段總肽段中，最大SI在濃度最大時出現（2000μg/mL），然而分離純化得到的各個范圍的肽段SI不同。除LR組中＞5kDa的最大 SI出現濃度為500μg/mL；L14組3～5kDa和 ＜3kDa的最大 SI出現濃度分別為1000μg/mL和500μg/mL外；其余SI均與濃度呈正比關系。Mercier等和Prioult等［10-11］也發現與目前使用的相似條件制備的WPI和β-lg肽段具有強烈的刺激脾細胞的增殖作用，可能是由于有不同化學性質（e.g.，pI）的肽段數目以及發生在復雜的混合物比如總水解液中的肽/肽之間的作用都降低而造成的。

圖5 不同濃度（50～2000μg/mL）的SM、LR、L14和AP對靜息期（A）和受ConA刺激的脾細胞（B）的增殖作用

受ConA刺激的脾細胞與靜息期脾細胞比較，各組在相同濃度下SI均增強。除LR＞5kDa外，各個肽段在高濃度（≥1000μg/mL）下與對照組細胞差異顯著。

3 結論

從分離純化結果可以看出，不同方法處理脫脂乳所得到的游離小肽的分子量分布不同，則說明不同的方法處理脫脂乳所得到的產物對小鼠脾細胞具有不同程度的免疫調劑活性。

根據實驗結果說明，未經處理的脫脂乳蛋白對靜息期脾細胞有輕微的刺激作用，但是對受ConA刺激的脾細胞則具有抑制作用，并與濃度呈正比關系。脫脂乳蛋白經LR、L14菌株發酵和胰蛋白酶水解后，得到的游離小肽對靜息期脾細胞均具有刺激作用，并且對受ConA刺激的脾細胞同樣產生刺激作用。該結果表明，發酵和水解脫脂乳是對脾細胞是否產生刺激作用的關鍵。

經過發酵或水解脫脂乳，得到不同性質及分子量的肽段均對靜息期和受ConA刺激的脾細胞具有刺激作用。在對靜息期的脾細胞作用中，除LR組和AP組分子量范圍＞5kDa的小肽之外，其他小肽的最大SI均與濃度呈正比關系。在受ConA刺激的脾細胞作用中，除AP組分子量范圍3～5kDa的小肽外，其他均與濃度呈正比。但是，同種處理方式所得到的不同分子量范圍的小肽具有不同程度的刺激作用，無倫何種處理方法，所得到的分子量范圍＜3kDa的小肽均具有較強的免疫活性。

［1］Cocco R R，Jarvinen K M，Sampson H A，et al.Mutational analysis of major，sequential IgE-binding epitipes in αs1-casein，a major cow’s milk allergen［J］.Allergy Clin Immunol，2003，112（2）：433-437.

［2］Wal J M.Structure and function of milk allergens［J］. Allergy，2001，56（67）：35-38.

［3］Williams S C，Badley R A，Davis P J.Identification of epitopes within beta lactoglobulin recognized by polyclonal antibodyes using phage display and pepscan［J］.Immunol Methods，1998，213：1-17.

［4］Jarvinen K M，Chatchatee P，Bardina L，et al.IgE and IgG binding epitipes on lactoglobulin in cow’s milk allergy［J］. Archives of allergy Immunol，2001，126：111-118.

［5］Friek O L，Teuber S S，Buehanan B B，et al.Allergen immunotherapy with Heat-killed Listeria monocytogenes alleviates peanut and food induced anaphylaxis in dogs［J］.Allergy，2005，60：243-250.

［6］Schlimme E，Meisel H.Bioactive peptides derived from milk proteins.Structural，physiological and analytical aspects［J］.Die Nahrung，1995，39：1-20.

［7］Meisel H.Biochemical properties of bioactive peptides derived from milk proteins：potential nutraceuticals for food and pharmaceutical appli-cations［J］.Livestock Prod Sci，1997，50：125-138.

［8］周建軍，樂秀芳，韓家嫻，等.評價抗癌物質活性的改良MTT方法［J］.中國醫藥工業雜志，1993，24：455-457.

［9］Diane S S，Sylvie F G，Yvan B，et al.Immunomodulating properties of a whey protein isolate，its enzymatic digest and peptide fractions［J］.International Dairy Journal，2008，18：260-270.

［10］Mercier A，Gauthier S F，Fliss I.Immunomodulating effects of whey proteins and their enzymatic digests［J］.International Dairy Journal，2004，14：175-183.

［11］Prioult G，Pecquet S，Fliss I.Stimulation of interleukin-10 production by acidic beta-lactoglobulin-derived peptides hydrolyzed with Lactobacillus paracasei NCC2461 peptidases［J］. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology，2004，11：266-271.

［12］郭鸰，任大喜，張英華，等.發酵生產低致敏乳源蛋白基料的研究［J］.食品與發酵工業，2007，33（10）：81-84.

［13］Kay J R M，Harsharnjit S G.Immunomodulating activity of protein concentrates derived from bovine milk whey in mice［J］. Nutrition Research，2005，25：157-166.

［14］Prioult G，Pecquet S，Fliss I.Allergenicity of acidic peptides frombovine β-lactoglobulin is reduced by hydrolysis with Bifidobacterium lactis NCC362 enzymes［J］.International Dairy Journal，2005，15：439-448.

Comparison of spleen lymphocyte proliferation between the skimmed milk products of lactobacillus fermentation and enzymolysis in mice

FENG Fang-fei1，GUO Ling1，*，LI Ji-chang2
（1.Key Laboratory of Dairy Science，College of Food，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China）

To investigate the effect of spleen lymphocyte proliferation（SLP）between the skimmed milk production of lactobacillus fermentation and enzymolysis in mice.Each product had been purified and separated by gel filtration method，and evaluated the effect of different treatment and different range of peptide on the SLP in mice.The results showed that the lactoprotein which fermented by lactobacillus and hydrolyzed by enzyme，especially the molecular weight of peptide＜3kDa had stronger immunomodulatory activity.This study confirmed that the method of fermentation and hydrolization could be used in exploiting the hypoallergenic protein ingredients from milk source.

fermentation；enzymolysis；spleen lymphocyte proliferation

TS201.1

A

1002-0306（2010）11-0068-04

2009-11-16 *通訊聯系人

馮芳菲（1984-），女，碩士研究生，研究方向：乳品營養與安全。

東北農業大學生物乳品創新團隊項目；黑龍江省博士后基金。