雙歧桿菌凍干菌粉制備過程中保護劑的研究

李德斌，趙敏

（東北林業大學，哈爾濱 150040）

雙歧桿菌凍干菌粉制備過程中保護劑的研究

李德斌，趙敏

（東北林業大學，哈爾濱 150040）

對雙歧桿菌真空冷凍干燥過程中使用的各種保護劑進行了研究，在各種保護劑中篩選出4種效果比較好的類型，配合成復合保護劑，在很大程度上提高了雙歧桿菌在凍干過程中的活菌存活率，達到71.11%的存活率。最后還進行了常溫和低溫保存實驗。

雙歧桿菌；計數方法；保護劑

0 引 言

雙歧桿菌（Bifidobacterium）最初是由法國巴斯德研究所的 Henry Tissier（1899年）從母乳喂養的嬰兒糞便中分離得到的，具有較好的保健作用，是目前益生菌制品中非常重要的品種之一[1，2]。但現在市售的雙歧桿菌活菌制品存在一個最為關鍵問題，就是產品在貯存和銷售過程中活菌數量會大量下降，導致效用降低，不能達到預期的目的。真空冷凍干燥技術[3]是目前微生物菌種保藏的主要應用技術之一，當微生物通過冷凍過程時，其體內的水分快速蒸發掉，只保持最低的水分質量分數，使其生理活動降低到最低程度，以增加微生物的壽命，延長其保藏期。所以將雙歧桿菌制成凍干的菌粉[4]，延長其保存時間，是目前生產上常用得手段之一。

在凍干工藝中，低溫和水分蒸發會對雙歧桿菌造成很大的傷害。如果直接冷凍雙歧桿菌菌液，會使雙歧桿菌的活菌數目大幅度下降。為了提高在凍干過程中雙歧桿菌的存活率，向雙歧桿菌菌液中加入保護劑是一種非常有效的方法。保護劑的種類有很多，一般用多羥基醇、多糖等物質。

1 試 驗

1.1 材料

試驗菌種：菌種編號為1.1852。

培養基：采用牛奶還原培養基和PTYG[5]培養基，其中PTYG作為菌種保存和計數培養基使用，有生成的菌落形態規整、易于生長等優點。

計數方法采用雙層平板計數方法[6，7]。

1.2 單一保護劑

1.2.1 保護劑的選擇與配置

選擇乳糖、可溶性淀粉、甘油、谷氨酸、蔗糖、葡萄糖和海藻糖7種保護劑。首先將其配置成一定濃度的母液，備用。

1.2.2 單一保護劑的添加

（1）菌液的生產。用無菌的移液管將1 mL雙歧桿菌菌液在無菌操作下，接入裝有30 mL牛奶還原培養基中，接種量約為3%，然后放入厭氧箱內恒溫培養32 h。

（2）保護劑的加入。將預先配好一定濃度的保護劑加入(見表1)到培養好的牛奶還原培養基中，混合均勻，同時用雙層培養基計數法檢驗雙歧桿菌菌液中雙歧桿菌的活菌數[8]。

（3）預凍。提前將安培瓶刷洗干凈，用報紙包好后在160℃下滅菌1 h。吸2 mL加好保護劑的雙歧桿菌菌液注到無菌安培瓶中，在-20℃的冰箱中預凍。

（4）凍干。把預凍好的安培瓶放入超低溫真空冷凍干燥機，到成為干粉狀。

表1 單一保護劑的加入量及最終質量分數

（5）封口。將裝有冷凍好的雙歧桿菌干菌粉的安培瓶，用酒精噴燈把安培瓶瓶口的玻璃燒化封好。

（6）冷藏。安培瓶封好后，放入-50℃冰箱中冷藏，待測。

1.3 復合保護劑

根據試驗結果，選擇保護作用較好的葡萄糖、海藻糖和可溶性淀粉等來配置復合保護劑。

1.3.1 復合保護劑質量分數的選擇

根據單一保護劑的作用效果來選擇復合保護劑的種類及濃度，具體情況如表2。

表2 復合保護劑質量分數的選擇情況

1.3.2 復合保護劑的添加

方法同單一保護劑的試驗方法。

2 結果與分析

2.1 保護劑對活菌率的影響

通過測定雙歧桿菌菌液在真空凍干干燥前后雙歧桿菌活菌數目，來對比單一保護劑對雙歧桿菌的保護作用，具體情況如表3所示。由表3中可以看出：

（1）本研究所采用的7種保護劑，共14種處理對雙歧桿菌的凍干過程均有一定的保護作用。

表3 真空冷凍干燥前后雙歧桿菌活菌數目對照

（2）在所有的保護劑及各種處理中，以葡萄糖（10%）作為保護劑時，活菌存活率（32.5%）最高，依次為谷氨酸（0.5%）、甘油（1%）、海藻糖（0.6%）、海藻糖（1.2%）、乳糖（1%）等。

（3）在雙歧桿菌菌液中加入保護劑的14種處理中，活菌存活率最低的是加入蔗糖（4%），其活菌存活率是5.42%，它也要比空白（不加入任何保護劑）的活菌存活率（2.5%）高一倍左右。而活菌率最高(葡萄糖10%)是空白的活菌率的13倍左右。

復合保護劑對活菌率的影響如表4所示。

表4 復合保護劑對活菌率的影響

由表4中得到如下結論：

（1）復合保護劑與單一保護劑相比，具有明顯的增強作用，可以顯著提高雙歧桿菌在真空冷凍干燥過程中的活菌存活率。

（2）這10種復合保護劑的處理中，以9號（甘油+葡萄糖+海藻糖）處理的活菌率最高，為71.11%；比單一保護劑處理時最好的保護效果（32.5%）提高近40個百分點；10號 （蔗糖+葡萄糖+海藻糖），活菌百分率是62.22%，也是比較理想的。最低的效果（12.00%）也比單一保護劑的最低效果（5.42%）提高2倍多。

2.2 常溫下凍干菌粉的活菌率

含有雙歧桿菌的生物制品的一個重要缺陷，就是常溫保存時活菌數下降過快。所以測定雙歧桿菌凍干菌粉在常溫保存時，活菌數目的變化情況對產品具有重要的意義。選擇具有代表性的4℃和25℃作為測定溫度更具有普遍意義。

表5 常溫保存對活菌數的影響

由表5可以看出：

（1）雙歧桿菌凍干菌粉無論在4℃和25℃保存下，其活菌數目都會下降，但是在4℃保存下，下降的趨勢比較緩慢，一般在10 d后下降一個數量級，而在25℃保存下，下降劇烈，5 d時測定其活菌數目時，就已經下降一個數量級；

（2）使用復合保護劑比使用單一保護劑的雙歧桿菌凍干菌粉中的活菌數，在相同的條件下，要高很多。

（3）不添加保護劑時，25℃保存，在10 d左右雙歧桿菌活菌數就已經微乎其微了，到第15 d時，就已經檢測不到了；4℃保存略好，但也不過延長5 d而已。

（4）添加單一保護劑時，25℃保存，可以保持較高的活菌數到10 d左右，15 d后，含量急劇下降，甚至檢測不到；4℃保存，可以順延5 d。

（5）添加復合保護劑時，效果最好，4℃可以保持較高的活菌數到25 d左右；25℃下，也可以到15 d。

（6）添加保護劑雖然可以適當延長雙歧桿菌凍干菌粉的保質期，但對于商業上的應用還是不夠的，所以還應該采取一些適當措施來提高含有雙歧桿菌的生物制品的保質期來提高產品的質量，如制成腸溶性微膠囊。

3 討 論

雙歧桿菌制品長期以來，一直難以克服的困難就是如何保持其具有較高的活菌數的問題?，F在一般采用膠囊或者微膠囊后密封保存的方式[9]，而生產這些產品的基礎就是生產出具有較高活菌數的凍干菌粉來。所以較好的凍干菌粉工藝是發展雙歧桿菌制品的基礎。本研究通過在雙歧桿菌凍干過程中加入各種保護劑來提高雙歧桿菌的存活率，從而生產出具有較高活菌數的雙歧桿菌制品。在凍干過程中加入了常見的各種凍干保護劑，發現單一的保護劑的效果還是遠遠沒有達到預期的效果，效率最好的葡萄糖（10%）也不過是32.5%，而通過加入多種保護劑，可以達到更好的效果，可以達到71.11%，這樣就會更好地滿足生產上的要求。

[1]丁可,余倩.雙歧桿菌檢測方法進展研究[J].現代預防醫學,2004,31(5):723-727.

[2]李德斌，趙敏，張靜.雙歧桿菌與微生態制劑.中國微生態學雜志.2003,15（6），371～372.

[3]CARVALHO A S,SILVA J,HO P,et al.Survival of Freeze-Dried Lacto-Bacillus Plantarum and Lactobacillus rhamnosus during Storage in the Presence of Protectants[J].Biotechnology Letter,2002,24(19):1587-1591.

[4]邵偉,樂超銀,熊譯,等.雙歧桿菌凍干粉制備工藝研究 [J].現代品科技,2008,21(4):54-56.

[5]杜連祥,趙征.乳酸菌及其發酵制品生產技術 [M].天津:科學技術出版社,1999.

[6]劉偉，李德斌，高利.雙歧桿菌計數方法的研究[J].食品科技，2010,35(9):34-36.

[7]王立平.最大可能數法計數乳品中雙歧桿菌數量的研究[J].食品科技，2011,36(5):260-2 63.

[8]許燕濱,謝光炎,楊汝德,等.雙歧桿菌微膠囊熱穩定性研究 [J].廣東工業大學學報,2001,18(4):86-88.

[9]PICOT A,LACROIX C.Effects of Micronization on Viability and Thermotolerance of Probiotic Freeze-Dried Cultures[J].International Dairy Journal,2003,13(6):455-462.

Study on protectant of freeze-drying Bifidobacterium powder in the preparation process

LI De-bin，ZHAO Min
(Northeast Forestry University,Harbin 150040，China)

All kinds of protectants were studied under the freeze-dry condition and four types of protectants,which have good effect,were screened out.The four protectants were mixed together forming the multiplex-protectant which can promotes the survival probability of bifidobnacterium on the process of freeze-dry greatly,the survival rate reached 71.11%.Finally,also carried out at room temperature and cold storage experiments.

Bifidobacterium;count method;protectant

Q93-335

A

1001-2230（2011）11-0032-03

2011-07-01

李德斌（1976-），男，工程師，從事微生物應用方面研究。