奶牛乳腺中瘦素及其受體的表達與定位

郭洪波，林葉，李慶章，邊艷杰，肖陽

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

奶牛乳腺中瘦素及其受體的表達與定位

郭洪波，林葉，李慶章，邊艷杰，肖陽

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

為探討瘦素在奶牛乳腺發育、泌乳及退化各時期的表達變化規律及在乳腺組織中的具體位置，采用免疫印跡（westernblotting）技術及激光共聚焦技術檢測奶牛乳腺組織中瘦素及瘦素受體（OB-Rb）的表達變化及其定位。結果表明，瘦素在青春期表達量較高，在泌乳期表達量最低。瘦素受體在青春期和妊娠期表達量較高，泌乳期表達量相對較低，退化期逐漸恢復到妊娠期水平。

奶牛；乳腺組織；瘦素；長型瘦素受體

0 引言

Zhang等[1]從遺傳性肥胖小鼠的脂肪組織中采用位置克隆技術首次克隆出小鼠的肥胖基因（ob基因），瘦素是ob基因的產物，主要由白色脂肪組織分泌的分子量為16 ku的蛋白質[2]。瘦素受體屬于Ⅰ型細胞因子受體超家族成員,長型瘦素受體（OB-Rb）在瘦素信號轉導中起主要作用。瘦素缺失或瘦素受體缺失的小鼠乳腺導管分支明顯減弱[3]。Lin等[4]發現瘦素可以促進小鼠妊娠期乳腺導管細胞的增殖和分化，誘導泌乳期β-酪蛋白基因表達，啟動退化期乳腺細胞凋亡并參與乳腺組織重建過程。李萌等[5]在研究瘦素對奶山羊乳腺相關功能影響實驗中也得出上述結論。本研究采用western blotting技術及激光共聚焦技術檢測奶牛乳腺組織中瘦素及OB-Rb的表達變化及定位，為闡明瘦素及其受體在奶牛乳腺發育和泌乳過程中的作用機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

澳大利亞荷斯坦奶牛奶牛按照實驗要求在東北農業大學阿城實驗動物養殖場飼養，取材備用。

實驗分期：青春期2個月，青春期12個月，青春期14個月;

妊娠期2個月，妊娠期4個月，妊娠期6個月；

泌乳期7日，泌乳期50日，泌乳期140日，泌乳期280日；

退化期3日，退化期30日。

上述n=3。

青春期奶牛乳腺組織取材：青春期是從出生之日開始算起，分別取青春期2個月、12個月、14個月奶牛乳腺，液氮凍存備用。

妊娠期奶牛乳腺組織取材：公牛和母牛交配次日記為妊娠1日，之后每隔3天用驗孕試紙檢測是否妊娠，同時取材時通過腹腔解剖觀察子宮狀態進一步鑒定是否妊娠，妊娠90 d后直接從外觀即可鑒定是否妊娠。分別取妊娠2個月、4個月、6個月奶牛乳腺，液氮凍存備用。

泌乳期奶牛乳腺組織取材：從分娩并開始泌乳日記為泌乳期，分別取泌乳7日、50日、140日、280日奶牛乳腺，液氮凍存備用。

退化期奶牛乳腺組織取材：泌乳結束后，即為自然退化3日、30日奶牛乳腺，液氮凍存備用。

1.1.1 試劑和儀器

試劑：Rabbit anti-bovine Ob（sc-842），Rabbit anti-bovine（Ob-R(H-300)，sc-8325），Goat anti–mouse FITC IgG sc-2092，Goat anti-rabbit IgG sc-2091，β-catemin mouse anti-bovine sc-2037，Mouse anti-bovine β-actin sc-47778，RAPI蛋白裂解液（P0013B），預染Marker（7～175ku），甲醇和冰乙酸等均為國產分析純試劑，硝酸纖維素膜，PX型醫用X-ray膠片，顯影液，定影液等。

u ER1，儀器：激光掃描共聚焦顯微鏡（TCS SP2），半干轉移電泳儀，冰凍切片機，電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 乳腺組織總蛋白提取

乳腺組織切碎，稱重。1∶20倍加入苯甲基磺酰氟化物（PMSF）的RAPI裂解液對組織進行勻漿，冰上靜置5 min，4℃下14 000 r/min離心15 min，收集上清液，進行后續western blotting實驗。

1.2.2 免疫印跡分析（westernblotting）

分別取青春期、妊娠期、泌乳期和退化期奶牛乳腺組織提取總蛋白，瘦素分子量為16 ku，故選擇5%的濃縮膠和15%的分離膠進行SDS-PAGE分析，長型瘦素受體選擇5%的濃縮膠和8%的分離膠進行SDSPAGE分析。電泳結束后將凝膠上的蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，室溫用脫脂牛奶封閉2 h，用3 mL 1∶500稀釋的兔抗牛瘦素抗體4℃孵育過夜。取出后用TBST洗3次，每次5 min，再用3 mL 1∶5 000稀釋的HRP-雞抗兔IgG，37℃搖床孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min發光液顯色，在暗室中曝光、顯影。

1.2.3 乳腺中瘦素及其受體的表達定位

取青春期、妊娠期、泌乳期和退化期奶牛乳腺組織制作冰凍切片，冷丙酮固定10 min后用PBS洗3次，每次10 min，10%山羊血清37℃孵育60 min，兔抗牛瘦素抗體4℃孵育過夜（抗體用PBS稀釋，稀釋比例1︰100）。取出后用PBS洗3次，每次5 min，FITC-山羊抗兔IgG 37℃孵育60 min（稀釋比例1︰200），PBS洗3次，每次5 min，DAPI染核15 min，PBS洗3次每次5min，用DABCO封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3 數據處理和統計分析

免疫組化：對奶牛每個時期切片3張進行試驗，每張切片選擇不同視野進行觀察，掃描拍照。Western blotting結果用bandscan4.3軟件分析。所得數據均以平均數±標準差表示，同一樣本不同處理的結果用SPSS統計分析軟件進行t檢驗，多組數據之間應用SPSS統計分析軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 乳腺中瘦素及其受體的表達定量

圖1為瘦素，OB-Rb，內參的Western blotting結果。圖1中，V，P，L，I分別表示青春期，妊娠期，泌乳期和退化期；m代表月，d代表日，下同。

圖2為奶牛乳腺中瘦素和OB-Rb的表達（P＜0.05）。由圖2可以看出，瘦素在青春期表達量最高，并逐漸降低；在整個妊娠期瘦素表達量變化很小，略有升高；泌乳期瘦素維持在低水平；退化期表達量顯著上調，到退化30 d瘦素表達量恢復到妊娠初期水平瘦素。

受體的表達量低于瘦素，表達變化規律與瘦素相類似。從而可以看出在乳腺發育、泌乳及退化的各個時期，瘦素的表達可正向誘導OB-Rb的表達。

2.2 奶牛乳腺中瘦素及其受體的表達定位

2.2.1 瘦素與β-catenin的表達定位

圖2為奶牛乳腺中瘦素的表達定位。由圖2可以看出，在青春期和妊娠早期，瘦素主要在乳腺脂肪細胞、大導管體細胞、帽細胞以及圍繞導管的基膜中被檢測到（圖3 A～C）。妊娠期，在脂肪細胞、導管上皮細胞和基膜中檢測到瘦素（圖3 D,E）。泌乳期瘦素存在于腺泡上皮細胞靠近基底側的部位以及細胞外基質中（圖3 F～I）。在退化期，瘦素殘留在導管上皮細胞和脂肪細胞中（圖3 J,K）。

圖3中，紅色信號a是β-catenin；綠色信號b是leptin；藍色信號c是細胞核；L是陰性對照。下同。

2.2.2 瘦素受體OB-Rb與β-catenin的表達定位

圖3為奶牛乳腺中瘦素受體OB-Rb的表達定位。在青春期和妊娠早期，主要在乳腺脂肪細胞、大導管體細胞、帽細胞以及圍繞導管的基膜中檢測到OBRb（圖3 A～C）。妊娠晚期，在脂肪細胞和導管上皮細胞中檢測到OB-Rb（圖3 D和E）。泌乳期，OB-Rb存在于腺泡上皮細胞靠近基底側的細胞膜上（圖3 F～I）。在退化期，OB-Rb存在于殘留的導管上皮細胞和脂肪細胞中（圖3 J和K）。

3 討論

瘦素主要由脂肪細胞合成分泌，在奶牛乳腺組織中也同樣如此[6]。青春期乳腺組織中瘦素及其受體的表達水平相對較高，這是由于青春期乳腺組織實體結構少，乳腺大部分被脂肪墊占據。妊娠期乳腺結構發生巨大改變，妊娠60～180 d乳腺以指數速率增加，分支小導管變長或變寬，脂肪組織迅速退化，乳腺中瘦素及其受體的表達量下降[7]。由于妊娠期缺少泌乳激素的作用，瘦素及其受體的表達量略有回升。這與Bonnet等運用免疫熒光技術對綿羊妊娠期乳腺中瘦素的定位研究結果相似[8]。泌乳期由于催乳素大量表達，瘦素及其受體的表達量維持在低水平。幼仔離乳后，乳腺退化在12 h內啟動，隨著乳腺實體組織的瓦解，乳腺脂肪墊重新生成，因此在退化階段乳腺組織中瘦素及其受體的表達逐漸增加，到退化30 d已經恢復到妊娠初期的水平[9]。

瘦素及其受體的激光共聚焦結果證明：牛乳腺組織中瘦素，與小鼠、大鼠、人類細胞內一樣具有自分泌和旁分泌的功能[10-12]。青春期瘦素除了在脂肪細胞中合成和分泌[13]，在導管上皮細胞和基膜中也檢測到瘦素的存在。這是由于脂肪細胞能合成、分泌瘦素,瘦素反過來作用于下丘腦維持著體脂的穩定性。妊娠期乳腺組織進入主要的發育階段，乳腺結構發生巨大改變。乳腺導管出現大量分支同時產生大量乳腺腺泡。直到分娩并開始泌乳，乳腺發育達到最大程度。妊娠早期，乳腺發育緩慢，此時乳腺中瘦素的表達含量變化不大。在這一階段，瘦素主要在脂肪細胞和導管上皮細胞中被檢測到。在泌乳期，乳腺導管末端完全發育成功能性腺泡，并維持腺泡結構和功能。乳腺腺泡由單層上皮細胞圍成的空腔組成，外周由網狀肌上皮細胞包圍，肌上皮細胞外被由結締組織組成的基膜圍繞。腺泡之間填充著由纖維原細胞、白細胞和其它結締組織細胞組成的基質，并伴有血管穿過基質間的空隙。此時瘦素主要在乳腺腺泡上皮細胞中表達，說明乳腺上皮細胞可以合成和分泌瘦素[4]。在乳腺退化過程中，乳腺組織功能性結構迅速消退，乳腺腺泡由于細胞凋亡的啟動而瓦解。此時瘦素主要在脂肪細胞和殘存的導管上皮細胞中被檢測到。

青春期，OB-Rb在脂肪細胞和導管上皮細胞中表達。Laud等[14]用RT-PCR方法證明，在妊娠和泌乳期綿羊乳腺中有長型和短型瘦素受體的表達，原位雜交結果顯示瘦素受體轉錄本在乳腺上皮細胞中特異性表達。O'brien[15]研究結果表明乳腺上皮細胞是瘦素合成和分泌的部位。妊娠期，隨著導管的發育，乳腺脂肪墊逐漸退化，在妊娠60～120 d，OB-Rb在脂肪細胞和導管上皮細胞中被檢測到；妊娠180 d，乳腺脂肪墊消失，功能性腺泡形成，OB-Rb專一性地在腺泡上皮細胞的細胞膜上表達。泌乳期，OB-Rb在腺泡上皮細胞的細胞膜上被檢測到，但其表達水平很低。同時乳腺中瘦素的表達也很弱，表明在泌乳期瘦素的功能不是維持乳腺結構、乳汁合成和分泌所必需的。退化期，OB-Rb在脂肪細胞和殘留的導管上皮細胞中表達。由于腺泡結構的瓦解和乳腺脂肪墊的重新生成，乳腺中OB-Rb的表達回升。在這一階段，瘦素是啟動退化期乳腺細胞凋亡的主要細胞因子，退化期瘦素功能性受體的高表達也說明瘦素在泌乳結束后乳腺組織重建的過程中必不可少[5]。

4 結論

奶牛乳腺整個發育過程中瘦素和瘦素受體的表達，青春期最高，妊娠期下降，泌乳期維持在低水平，退化期顯著升高，在退化30 d恢復到妊娠初期水平。瘦素及其受體在乳腺不同時期細胞中分布變化表明，瘦素專一性誘導OB-Rb的表達，且通過與OB-Rb的結合調控乳腺的發育和生理功能。

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Expression and localization of leptin and its receptor in mammary gland of dairy cow

GUO Hong-bo,LIN Ye,LI Qing-zhang,BIAN Yan-jie,XIAO Yang
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The protein expression and localization of leptin and its long form receptor(OB-Rb)were detected by western blottig methord and a confocal laser scanning microscope.The results showed that leptin protein level was higher in virgin,the lowest in lactation.Then OB-Rb was higher in virgin and pregnancy,lower in lactation,and recovered to the original level in involution.

dairy cow;mammary gland;leptin;OB-Rb

TS252.1

A

1001-2230（2011）06-0008-04

2011-01-20

國家自然科學基金資助項目（30671538）；東北農業大學創新團隊項目（CXT005-1-1/CXT005-1-2）。

郭洪波（1984-），女，碩士研究生，研究方向為動物生物化學與分子生物學。

李慶章