饑餓對金魚卵巢型和腦型芳香化酶基因表達的影響研究*

溫海深,王宇龍,姜 龍,李吉方,何 峰,劉 淼

(中國海洋大學海水養殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

細胞色素P450芳香化酶(P450arom)作為P450細胞色素酶超家族中的一員,是類固醇生成途徑中的末端酶,它是雄激素向雌激素轉化的關鍵限速酶[1]。它能夠催化某些雄激素(如睪酮和雄烯二酮)轉化為雌激素,對調節整個性類固醇激素的平衡有重要意義[2]。在大多數脊椎動物中,P450arom由CYP19單基因編碼,但在魚類中存在2種P450芳香化酶,分別為性腺型芳香化化酶(P450arom A)和腦型芳香化酶(P450aromB),它們由不同的基因(CYP19A和CYP19B)編碼,具有獨特的功能[3]。至今,已經在10余種魚類中克隆了CYP19基因,并對功能進行了初步研究[4]。

由于環境條件改變、個體差異及食物分布不均等原因,魚類經常遭受饑餓脅迫。近年來,饑餓脅迫對魚類生理機能變化研究成為魚類營養與環境生理學交叉學科的熱點問題之一,特別是饑餓后的消化生理機能研究報道較多,例如補償生長現象。魚類補償生長現象是魚類遇到饑餓脅迫,恢復攝食后生長率高于正常攝食狀態,體重增加最終達到或超過正常投喂魚的現象。魚類補償生長的研究可用來指導制訂科學的投食制度而獲得更好的經濟效益,迄今為止,國內外先后研究了鮭科魚類、鯉科魚類、鱈科魚類、鰈科魚類等近30余種魚類的補償生長。在我國1990年代以后開始研究,涉及魚類如南方鲇(Silurusmerid ionalis)[5]、鯉魚(Cyprinus carpio)[6]、美國紅魚(Sciaenops ocellatus)[7]、異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[8]、錦鯉(Cyprinus carpio,variation)[9]。真鯛(Pagrus major)[10]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[11]。但是,關于魚類補償生長過程中繁殖生理機能變化研究未見報道。本文以繁殖生理研究的模式動物金魚(Carassius auratus,variation)為對象,側重研究性激素合成關鍵酶基因(CYP19A和CYP19B)表達對饑餓的響應機制,通過這些研究,在理論上豐富魚類繁殖生理學內容,在實踐上為制定科學合理的親魚投喂計劃提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的金魚于2009年11月5日購于青島市某金魚養殖場,為同一批親魚孵化。選用同一規格的健康活潑的雌性個體84尾,在4個規格為30 cm×60 cm×30 cm的玻璃水族箱內暫養(每箱21尾)10 d,每日投喂同種配合飼料2次至飽食。暫養后金魚體長為(6.6±0.8)cm,體質量為(38.8±10.1)g,卵巢發育為III期。暫養及實驗期間連續充氣,日換水量2/3,日光照時間12 h。暫養及實驗用水為提前經過2 d曝氣并調好水溫的自來水,水溫(18.1±0.8)℃,p H值為7.84～8.12,硬度為4.46 mmol/L。

1.2 實驗分組及取樣

設1個對照組和3個饑餓處理組,分別為A組(對照組,持續投喂15d,放魚48尾)、B組(饑餓5 d,放魚12尾)、C組(饑餓10 d,放魚12尾)和D組(饑餓15 d,放魚12尾)。實驗持續時間為15 d。取樣時間:第0天,取A組;第5天,取B組;第10天,取C組;第15天,取D組。每次取樣每組取3尾,每尾采集的組織為心、肝、脾、腎臟、卵巢、鰓、腦、頭腎、腸和肌肉,采集時放入液氮中速凍,然后轉移至-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.3 試劑來源

本實驗所用18S和PCR特異性引物均由上海生工生物技術公司合成。Taq酶、DNase(RNasefree)、RNasin、RNA提取試劑Trizol Reagent、M-MLV購自TaKaRa公司,普通瓊脂糖凝膠、Marker、購自北京天根生化科技有限公司,其余為國產分析純試劑。

1.4 基因表達

1.4.1 組織總RNA的提取及RNA中DNA去除取-80℃保存的腸、鰓、心、脾、腎、頭腎、精巢、肝、肌肉、腦組織各100 m g,用RNAiso Reagent抽提總RNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以DNase I酶去除基因組DNA,紫外分光光度計測定RNA濃度。

1.4.2 RNA反轉錄為cDNA 根據TaKaRa公司的M-MLV反轉錄體系(RNA 1μg,Oligo-d T18 1μL,補充RNase-free水至6μL)進行cDNA第一鏈的合成。70℃加熱10 min,后迅速在冰上冷卻。繼續加入MMLV Buffer 2μL,M-MLV 1μL,Rnase inhibito r 0.25 μL,dN TPs 0.5μL。經過42℃60 min,70℃15 min,95℃加熱5 m in,反應結束。合成的cDNA保存于-20℃備用。

1.4.3 CYP19基因的組織表達 將cDNA稀釋10倍后取1μL作為模板進行PCR擴增。利用Primer 5.0軟件設計2對PCR特異性引物CYP19A F、CYP19AR、CYP19B F和CYP19BR(見表1和2),特異性片段長162 bp。PCR反應條件為94℃5 min,94℃30 s、61.2℃(A)&60.9℃(B)30 s、72℃30 s共45個循環,72℃10 min。18S rRNA作為反應的內參照物。取5μL的PCR產物進行電泳。對電泳結果采用Tanon GIS凝膠圖象處理系統進行分析。

1.4.4 饑餓對CYP19基因在腦和卵巢中表達的影響

隨機選饑餓0(對照組)、5、10和15 d的金魚各3條,取每條魚的腦和性腺2個組織提取RNA,反轉錄得到cDNA,并稀釋后進行不同饑餓時間的CYP19A和CYP19B基因表達分析,反應條件同上。

1.5 數據處理

所有數據均采用平均值±標準差(Mean±S.D.)表示,不同處理組數據采用ANOVA單因素方差分析進行顯著性檢驗。實驗數據統計分析使用SPSS l2.0軟件。某組織的CYP19基因相對表達量=該組織CYP19基因表達量/該組織18S rRNA基因表達量。

表1 雌性金魚性腺型芳香化酶基因(CYP19A)的表達所用引物Table 1 Primers used fo r goldfish CYP19A gene cloning and m RNA exp ression analysis

表2 雌性金魚腦型芳香化酶基因(CYP19B)的表達所用引物Table 2 Primers used for goldfish CYP19B gene cloning and m RNA exp ression analysis

2 結果

2.1 雌性金魚CYP19A基因的組織表達

取正常投喂的金魚的卵巢、腦、肝臟、腸、心、脾、頭腎、腎、鰓和肌肉10個組織,用以上半定量RT-PCR的方法測定其CYP19A基因的表達情況。結果表明,該基因在上述10種組織中都有表達;但只是表達量有所差異:性腺中表達最豐富,心臟中最少(見圖1,2)。

2.2 饑餓對雌性金魚CYP19A基因在腦和卵巢中表達的影響

隨機選饑餓5、10和15 d的金魚各3條,取每條魚的腦和性腺2個組織用以上半定量RT-PCR的方法測定其CYP19A基因的表達情況;得出數據再同對照組的結果相比較,結果見圖3。對照組中性腺表達水平顯著高于腦中(P<0.05),說明性腺型芳香化酶主要在性腺中表達。CYP19A基因在腦和性腺中的表達規律相似:饑餓5 d時表達量顯著降低至較低的水平(P<0.05),饑餓期間,表達水平無顯著差異(P>0.05)。

圖1 CYP19A基因m RNA在雌性金魚各組織表達Fig.1 Them RNA exp ression of CYP19A gene in tissues of female goldfish

圖2 CYP19A基因m RNA在雌性金魚各組織的相對表達量Fig.2 Relative exp ression level of CYP19A in tissuesof female goldfish

圖3 饑餓脅迫對雌性金魚CYP19A基因m RNA在腦和卵巢中表達的影響Fig.3 Effects of starvation stress on relative exp ression level of CYP19A in ovary and brain of goldfish

2.3 雌性金魚CYP19B基因的組織表達

取正常投喂的金魚的卵巢、腦、肝臟、腸、心、脾、頭腎、腎、鰓和肌肉10個組織,用以上半定量RT-PCR的方法測定其CYP19B基因的表達情況。結果表明,CYP19B基因僅在以下6種組織中有表達:肌肉、腦、心、頭腎、脾和性腺。表達量也有差異:腦中表達最豐富,其余依次為:頭腎、性腺、脾、肌肉和心臟(見圖4,5)。

2.4 饑餓對雌性金魚CYP19B基因在腦和卵巢中表達的影響

隨機選饑餓5、10和15 d的金魚各3條,取每條魚的腦和性腺2個組織用以上半定量RT-PCR的方法測定其CYP19B基因的表達情況;得出數據再同對照組的結果相比較,結果見圖6。對照組中腦表達水平顯著高于性腺中(P<0.05),說明腦型芳香化酶主要在腦中表達。CYP19B基因在腦的表達規律:饑餓5 d時表達量顯著降低至較低的水平(P<0.05),饑餓期間,表達水平無顯著差異(P>0.05)。CYP19B基因在性腺的表達規律:饑餓5 d時表達量顯著降低至較低的水平(P<0.05);饑餓10～15 d,表達水平顯著上升(P<0.05),但仍然顯著低于對照水平(P<0.05)。

圖4 CYP19B基因m RNA在雌性金魚各組織表達的凝膠成像圖Fig.4 The m RNA exp ression of CYP19B gene in tissues of female goldfish

圖5 CYP19B基因m RNA在雌性金魚各組織的相對表達量Fig.5 Relative Expression level of CYP19B in in tissues of female goldfish

3 討論

CYP19A基因在金魚卵巢中具有非常高的表達水平,說明卵巢型芳香化酶主要在性腺中發揮作用,這與先前在其它魚類所取得的研究結果是一致的。除性腺外,肝臟內的表達量位居第二,原因可能在于,肝臟中多量的芳香化酶通過促使循環血液中的雄激素轉化為雌二醇,進而刺激肝臟合成卵黃蛋白原[4]。腦中的表達量相對較低,推測可能與硬骨魚類2種芳香化酶基因的組織特異性表達有關,即在腦組織中,表達量更大、發揮更多作用的是CYP19B基因。M eital等[19]通過測定不同卵巢發育階段的絲足魚2種CYP19基因的表達水平,認為2種芳香化酶在功能上存在差異。李廣麗等研究表明[4],赤點石斑魚(Epinephelus akaara)雌魚性腺型芳香化酶的表達量依次是性腺、垂體、鰾、鰓、頭腎、中腦,本研究與該結果一致,也與金魚[12]、虹鱒(Oncorhynchus m ykiss)[13]、半滑舌鰨(Cynog lossus sem ilaevis)[14]的研究結果類似。但是徐跑等報道[15],P450arom A在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)前腦、下丘腦、腦垂體、精巢、肝臟中不表達,只在卵巢中表達,并推測其對卵巢發育起著重要作用,與金魚、赤點石斑魚等表達規律不同。M akoto等[20],使用RT-PCR技術定量分析大西洋庸鰈(H ippog lossus hippog lossus)卵巢型和腦型芳香化酶基因表達,發現CYP19A基因在卵巢中表達量最高,其次為脾臟,在肝臟及心臟中未見表達。這些不同實驗結果存在差異的原因,可能在于采樣時魚體所處生長發育階段的不同(是否達到性成熟、性腺發育周期),或是魚類的種間差異(不同的產卵類型)。

圖6 饑餓脅迫對雌性金魚CYP19B基因m RNA在腦和卵巢中表達的影響Fig.6 Effects of starvation stress on relative exp ression level of CYP19A in ovary and brain of goldfish

CYP19B基因表達以腦中最多,證明腦型芳香化酶直接參與了腦組織中雌激素的合成;CYP19B在卵巢中表達量也較高,說明腦型芳香化酶也參與卵巢發育過程的調節。李廣麗等報道[4],赤點石斑魚雌魚腦型芳香化酶表達量在腦組織最高,與本研究結果相似。徐跑等則發現[16],P450arom B在腦、卵巢和精巢均有表達,腦部表達量高于性腺,與本實驗結果完全一致。Tchoudakova和Callard)證實[17],金魚P450arom B只在腦中表達,在卵巢中沒有檢測到,可能與性腺發育期有關。本研究用于實驗的雌性金魚卵巢發育期為III期,即正處于卵黃積累時期,卵巢中2種基因表達均處于活躍期,與卵巢發育期吻合。

經過饑餓處理5、10、15 d的金魚,其CYP19A和CYP19B基因m RNA在卵巢和腦中的表達水平,與正常投喂的對照組相比,均呈現顯著降低(P<0.05)。但是在3個饑餓處理組之間,基因表達水平無顯著差異(P>0.05),相對表達量始終維持在相對穩定的水平。

雌激素參與性別分化、性腺的生長和發育、調控繁殖行為以及卵黃蛋白原的肝臟合成(Lange等)[21]。而芳香化酶的主要功能是催化雄激素轉化為雌激素。因此,可以推斷在饑餓脅迫條件下,CYP19基因表達水平顯著降低可能使雌激素合成受阻,并且進一步影響卵黃蛋白原的合成以及卵巢組織的發育。

沈文英等[22]報道,饑餓延緩了銀鯽卵巢的發育:饑餓4周以及饑餓2周后再投喂2周的銀鯽,其性腺成熟系數均顯著低于投喂組;饑餓1～4周其卵徑均顯著低于投喂組,饑餓2周后再投喂2周卵徑仍顯著低于投喂組。任崗等[23]在對異育銀鯽的研究中發現,處理組饑餓1周,魚體GSI極顯著低于投喂組。在對血液中SPP和SPC含量測定后,發現饑餓2周,導致SPP和SPC含量均極顯著低于投喂組。說明饑餓使異育銀鯽的卵巢發育受到了抑制。在恢復投喂后異育銀鯽的GSI、LSI、SPP、SPC含量均有所回升,但仍明顯低于投喂組的水平。

但是,對于饑餓導致芳香化酶基因表達水平下降的機制,目前尚無報道。推測金魚在受到饑餓脅迫后,由于缺乏卵巢發育所必須的營養物質、甚至產生發育停滯退化,從而削弱了機體對于雌激素的需求,故導致芳香化酶基因表達水平下降。若以上假設成立,則能夠解釋在饑餓后再次投喂產生的補償生長過程中,卵巢發育的恢復滯后于身體生長的現象[22-23]。也能夠說明,在饑餓脅迫下,魚體處于1種“生存應激”狀態下,盡量抑制繁殖活動以安全度過饑餓應激時期。

在本研究中,5 d內魚體就能夠及時調控內分泌并強烈抑制性腺發育,可能體現了魚體在進化上應對饑餓脅迫高度的敏感性和適應性。金魚雌魚在饑餓脅迫5 d之后,性腺發育基本停滯甚至退化,開始分解較成熟卵母細胞的卵黃囊以維持基本生命活動(姜龍,2010年未發表的數據)。這一過程可能與芳香化酶活性受到抑制的現象相適應,因為芳香化酶的主要功能是促進卵黃積累和卵母細胞成熟分化,當卵巢處在發育緩慢、停滯和退化的過程中,雌激素的合成受到抑制,卵巢和腦部芳香化酶基因的表達也經過復雜的調節之后被反饋抑制?？梢?芳香化酶基因的表達及其所作用效果,始終受到復雜而又精密的神經-內分泌調節,這一生理機制有待于進一步研究。

因此,金魚腦型芳香化酶在腦和卵巢中的表達受到饑餓脅迫后的變化規律:饑餓5 d時表達量顯著降低至較低的水平(P<0.05),隨后表達水平維持穩定。推測雌魚在饑餓條件下,雌激素合成量銳減,卵巢發育緩慢甚至停滯,以度過饑餓期。

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