銅綠假單胞菌及其L型誘導血管內皮細胞凋亡的實驗研究＊

陳登宇,劉 勇,徐萍萍,夏佩瑩

血管內皮細胞襯覆于血管內壁,是構成血管通透性屏障的主要結構,在機體血液循環和免疫防御方面發揮重要作用。本實驗用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)及其L型刺激體外培養的血管內皮細胞,采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率,Giemsa染色觀察細胞形態變化判斷細胞受損情況,并比較PA和PA-L型致細胞病變作用的差異,以探討銅綠假單胞菌感染引起的敗血癥和感染性休克時對血管內皮細胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 菌株 銅綠假單胞菌標準菌株:CMCC10104株,購于中國藥品生物制品檢定所。采用平板紙片法,以哌拉西林藥物紙片誘導銅綠假單胞菌成穩定L型[1],傳代培養獲得新鮮培養物,用無菌3%NaCl高滲鹽水制成108CFU/ml菌液;常規細菌培養獲得對數生長期的原菌,用無菌生理鹽水制成108CFU/ml菌液,計數采用麥氏比濁法。

1.2 細胞系 人血管內皮細胞株 ECV-304,購于中科院上海細胞生物學研究所。

1.3 主要試劑 Annexin V FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒,購于深圳晶美生物工程有限公司;Giemsa染色液母液,Sigma公司。

1.4 主要儀器 流式細胞儀 FACS Calibur:美國BD公司;光學顯微鏡:日本Nikon。

1.5 細胞培養 將低溫凍存的 ECV-304細胞復蘇,加入 RPMI-1640+10%FCS培養液,置 37℃、5%CO2孵箱中培養,收獲指數生長期細胞,以105/mL濃度接種于24孔細胞培養板、每孔2mL細胞懸液,常規培養12h后棄去陳舊培養液,更換成不含小牛血清的新鮮RPMI-1640培養液進行試驗。

1.6 實驗分組及誘導 實驗分組如下:A組:PA誘導組,在細胞培養板試驗孔中每孔加用無菌生理鹽水制成108CFU/mL銅綠假單胞菌菌液100μL;B組:PA-L型誘導組,在細胞培養板試驗孔中每孔加用無菌高滲鹽水(3%NaCl溶液)制成108CFU/mL銅綠假單胞菌L型菌液100μL;C組:生理鹽水對照組,在實驗空白對照孔中加100μL無菌生理鹽水。各組于誘導因素加入后 2、4、6、8、10h分別收集細胞,0.25%胰蛋白酶消化為單個細胞懸液,進行Annexin V-FITC/PI雙染后流式細胞儀檢測細胞凋亡率。若做細胞爬片,在細胞培養板各孔預置清潔無菌小玻片,后進行實驗,在各時間點將細胞爬片取出行 Giemsa染色。

1.7 細胞凋亡檢測

1.7.1 流式細胞儀法 采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測凋亡細胞,操作方法:用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞成單個細胞懸液;用4℃預冷的PBS染色緩沖液洗滌細胞兩次(1000r/min×5min);200μL結合緩沖液洗滌細胞 1次(1000r/min×5min),棄上清,管底留 20μL 結合緩沖液 ,混勻;加入 2μL Annexin V-FITC 和 5μL PI,稍加振蕩,室溫下避光孵育15min;1h內上機、流式細胞儀檢測,Cellquest軟件獲取數據,WinMDI 2.9軟件分析細胞凋亡率。

1.7.2 Giemsa染色 細胞爬片用4%多聚甲醛固定20min;在爬片上滴加新鮮配制 Giemsa染液應用液,染30min,沖洗干燥鏡檢。

1.8 統計學方法 采用q檢驗,SPSS10.0統計分析軟件進行數據處理。

2 結 果

2.1 流式細胞術檢測細胞凋亡結果 通過 FITC和PI熒光做雙參數點圖,可將實驗樣品細胞分為4區:Annexin V-FITC-/PI-(左下象限:LL區)代表正?；罴毎?Annexin V-FITC+/PI-(右下象限:LR區)代表早期凋亡細胞;Annexin V-FITC+/PI+(右上象限:UR區)代表晚期凋亡和壞死細胞;Annexin V-FITC-/PI+(左上象限:UL區)代表機械性損傷細胞。流式細胞儀檢測結果見圖1～圖6,統計結果顯示:PA和PA-L型感染組與對照組相比,血管內皮細胞在各時間段的凋亡率均明顯增高(P<0.05或P<0.01);PA感染組與PA-L型感染組相比,血管內皮細胞在6h和8h時間段的凋亡率均明顯增高(P<0.01)(見圖4)。隨著誘導時間的延長,在前8h內各組細胞的凋亡率逐漸增加(P<0.05或P<0.01),銅綠假單胞菌細菌型誘導組在8h時間點出現細胞凋亡高峰(見圖5)。實驗中,細胞總體死亡(凋亡和壞死)的比例顯著(P<0.05或P<0.01)(見圖6),說明 PA及其L型引起血管內皮細胞既有凋亡,又有大量壞死。

2.2 Giemsa染色觀察結果 在銅綠假單胞菌及其L型誘導組均觀察到凋亡細胞,PA-L組比PA組數目少,有細胞皺縮、染色質濃縮、核斷裂、細胞膜泡化和凋亡小體形成等細胞凋亡時具有的特征性形態學變化(見圖7);對照組,具有凋亡細胞特征形態的細胞少見。

3 討 論

血管內皮細胞襯覆于血管內壁,是構成血管通透性屏障的主要結構,參與體內許多生理和病理過程,發揮凝血及免疫防御作用[2-3]。銅綠假單胞菌感染引起的敗血癥和感染性休克與血管內皮細胞損傷有關,而細菌L型為細菌在體內抗菌物質作用下的常見存在形式,本實驗研究 PA及L型對體外培養的血管內皮細胞的影響,探討該菌對血管內皮細胞的損傷作用。

圖1 對照組血管內皮細胞凋亡流式圖Fig.1 Flowcytometric figures of vascular endothelial cells apoptosis in control groupFrom left to right,cells apoptosis ratios were 0.50%in 2h,0.70%in 4h,0.69%in 6h,1.42%in 8h,and 1.69%in 10h

圖4 流式細胞儀檢測各組不同時間血管內皮細胞早期凋亡率比較(ni=4,±s)Fig.4 Apoptosis ratios of vascular endothelial cells in different groups were compared(ni=4,±s)q test:compared to control group＊P<0.05＊＊P<0.01compared to PA-L group#P<0.01

圖5 流式細胞儀檢測各組內不同時間段細胞凋亡的時相變化(ni=4,±s)Fig.5 Apoptosis ratios of vascular endothelial cells in different time were compared(ni=4,±s)q test:compared to previous time＊P<0.05＊＊P<0.01

實驗中將PA及L型與血管內皮細胞共培養,采用Annexin V-FITC/PI雙染、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。Annexin V可與凋亡早期細胞的胞膜翻向外側的磷脂酰絲氨酸結合,為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一;碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)不能透過完整的細胞膜,能夠透過細胞膜不完整的凋亡中晚期的細胞和壞死細胞細胞膜而使細胞核染紅。將Annexin V和 PI兩者結合使用,利用流式細胞儀檢測可準確的檢測出細胞膜完整的凋亡細胞的比例。實驗中發現PA及L型可明顯誘導血管內皮細胞凋亡,并且隨著作用時間的延長,細胞凋亡率隨之增加,說明PA及L型具備誘導血管內皮細胞凋亡的能力。PA引發血管內皮細胞凋亡可能與內毒素有關,細菌內毒素脂多糖是PA的一種重要致病物質,可激活血管內皮細胞產生大量的細胞因子和炎癥介質,如 TNF-α和 NO等,誘導細胞凋亡[3-4]。PA的Ⅲ型分泌系統產生的外毒素和菌體表面的菌毛也可上調細胞表面 Fas的表達,導致細胞凋亡[5-6]。PA-L型較其原菌誘導血管內皮細胞凋亡能力明顯減弱,原因可能為PA變異為L型后,細胞壁結構發生改變,菌毛、孔道蛋白等黏附結構減少降低細菌對宿主細胞的黏附能力,致病物質如內毒素、外毒素等較原菌大為減少,減弱了細菌對細胞的損傷作用。

圖6 流式細胞儀檢測各組不同時間血管內皮細胞總死亡率比較(ni=4,x ±s)Fig.6 Total dead ratios of vascular endothelial cells in different groups were compared(ni=4,x ±s)q test:compared to control group＊P<0.05＊＊P<0.01compared to PA-L group#P<0.01##P<0.01

圖7 PA組凋亡細胞 Giemsa染色 ×400細胞皺縮、核固縮Fig.7 Apoptosis cells in PA group Giemsa stain×400 cell shrinkage,nuclear condensation

銅綠假單胞菌感染時可釋放毒素誘導血管內皮細胞凋亡,而血管內皮細胞異常凋亡增多會造成血管內皮細胞減少,損傷血管結構和影響血管功能,會導致循環系統功能紊亂和細菌擴散能力加強,造成PA及其L型感染難以控制,病情惡化,誘發DIC和感染性休克的發生。銅綠假單胞菌L型常與其原菌混合感染,不易清除常導致慢性感染的發生,PAL型可誘導血管內皮細胞凋亡可能是其致病機制之一。雖然單一的細胞體外培養模型不能完全反映體內血管損傷的復雜過程,但可從一個側面在一定程度上反映銅綠假單胞菌及其L型對細胞的損傷作用,故體外研究該菌誘導血管內皮細胞凋亡,有助于闡明銅綠假單胞菌及其L型感染損傷血管內皮細胞引起引起循環功能紊亂導致敗血癥及感染性休克的致病機制,以期用于指導臨床防治銅綠假單胞菌及其L型引起的嚴重感染。

[1]陳登宇,夏佩瑩,孟慶榮.銅綠假單胞菌L型的誘導及其產綠膿菌素能力的研究[J].實用醫藥雜志,2008,25(1):77-79.

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