外環境樣本中產毒型O1群霍亂弧菌雙重熒光定量PCR快速檢測方法的建立＊

黃世旺,徐丹戈,徐昌平,張 政,方葉珍,包芳珍,李 劍,蔣雪鳳,盧亦愚

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是引起烈性腸道傳染病霍亂的病原菌,其傳統檢測多以細菌培養法為主,操作繁瑣、費時費力。近年來,人們逐漸將PCR、熒光定量PCR技術引入到霍亂弧菌的快速檢測中[1-4],這對霍亂疫情的早發現、早診斷、早隔離、早治療起到了積極的作用。但PCR檢測需要開蓋電泳易受污染造成假陽性的發生,使其在應用上受到了一定限制;而目前在熒光定量PCR診斷方面大多停留在單重熒光檢測階段[4]或是僅應用于臨床前研究。我們在2006年建立熒光定量PCR快速檢測霍亂弧菌方法[5]的基礎上,進一步深入研究,建立了雙重熒光定量PCR快速檢測O1群霍亂弧菌技術,并采集352件外環境樣本對建立的雙重熒光定量PCR檢測技術進行了臨床驗證,取得了滿意的效果,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與臨床樣本 O1群霍亂弧菌(小川型)、O139群霍亂弧菌、創傷弧菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、甲型副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、奇異變形桿菌、大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌由浙江省疾病預防控制中心與省內相關疾控中心提供。

外環境監測樣本:2008年杭州市某區4-11月份采集的352件外環境樣本。

1.2 引物與探針 從 GenBank上分別下載rfbO1和CT基因序列,進行同源性比對后,在rfbO1基因保守區域設計特異性引物和 Taqman探針,探針5′端標記HEX熒光報告基團,在CT基因保守區域設計特異性引物和 Taqman探針,探針 5′端標記ROX熒光報告基團。引物和探針均委托 TA KARA公司合成,序列見表1。

表1 霍亂弧菌CT基因、rfbO1基因引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probe for rfb-O1 and CT gene ofVibrio cholerae

1.3 菌種培養和模板DNA提取 無菌條件下將各種菌株接種于營養肉湯中,36℃培養過夜復蘇;劃線于營養瓊脂平板,36℃倒置培養過夜;挑取單菌落重新接種于營養肉湯,增菌6h,用“煮沸法”提取核酸:即取1mL上述增菌液加入1.5mL離心管中,4 000r/min離心 6min富集,去上清,加入 100μL DEPC水重懸,煮沸 10min,10 000r/min離心 2 min,吸取上清液作為模板DNA,-80℃保存備用。1.4 病原菌的定量標準 純培養增菌6h,取一份菌液,煮沸 10min后測 OD492nm值,調節濃度使OD492nm=0.1(相當于 1.0 ×107cfu/mL)[6],依次作10倍稀釋,備用。另取一份菌液調至相同濃度,進行10倍稀釋并涂布,每個稀釋度涂布3塊平板,進行平板計數。

1.5 單重、雙重熒光定量PCR反應體系和反應條件 單重、雙重熒光定量PCR均采用 Ta KaRa公司的 Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒,在Mx3000P型熒光定量PCR儀上進行檢測。在單重熒光定量PCR反應體系和反應條件優化的基礎上,雙重熒光定量PCR采用的反應體系和反應條件如表2。

1.6 雙重熒光定量PCR的特異性、敏感性和重復性 提取O1群霍亂弧菌、O139群弧菌弧菌、創傷弧菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、沙門菌、志賀菌等核酸,用建立的雙重熒光定量PCR系統進行檢測,驗證體系的特異性。同時對已定量的O1群霍亂弧菌標準株稀釋后分別提取DNA,平行進行單重與雙重熒光定量 PCR,比較其敏感性,并構件標準曲線驗證體系穩定性。

表2 雙重熒光定量PCR反應體系和反應條件Table 2 The reaction conditions of the multiplex real-time quantitative PCR method

1.7 結果判定方法 霍亂弧菌rfbO1、CT基因分別用HEX和ROX熒光信號來標記。當rfbO1陽性、CT陽性時,鑒定為產毒型O1群霍亂弧菌;當rfbO1陽性、CT陰性時,鑒定為非產毒型O1群霍亂弧菌;當rfbO1陰性、CT陽性時,鑒定為產毒型非O1群霍亂弧菌。

檢測結果以Ct值<37并且擴增曲線呈S型為陽性判定原則,其中Ct值<35且擴增曲線良好可直接判定為陽性,Ct值在35～37之間需重復實驗,兩次實驗均能得到良好S型擴增曲線方可判定為陽性。

1.8 外環境樣本中標本核酸制備

1.8.1 外環境樣本的采集和處理

1.8.1.1 海水產品(除甲魚外) 取腮部和腸內容物或貝殼內軟組織25g,剪碎后加入225mL堿性蛋白胨水中37℃增菌6h(突發疫情時先增菌1h,挑取部分上層增菌液進行熒光定量PCR檢測,其余繼續增菌至6h)后,挑取以上樣本的上層增菌液進行熒光定量PCR檢測和傳統細菌培養;同時取2-3滴轉種于10mL堿性蛋白胨水中作第二次增菌,37℃增菌6h后再進行熒光定量 PCR檢測和傳統細菌培養。

1.8.1.2 甲魚 用5-6支無菌棉簽反復涂抹活甲魚體表(特別是泄殖腔、腳趾及其周圍皺褶處),轉入100 mL堿性蛋白胨水中37℃增菌6h后(突發疫情時先增菌1h,挑取部分上層增菌液進行熒光定量PCR檢測,其余繼續增菌至6h),挑取以上樣本的上層增菌液進行熒光定量PCR檢測和傳統細菌培養;同時取2～3滴轉種于10mL堿性蛋白胨水中作第2次增菌,37℃增菌6h后再進行熒光定量 PCR檢測和傳統細菌培養。

1.8.1.3 外環境水樣 用滅菌廣口瓶采集500mL,取450 mL加入10倍堿性蛋白陳水50 mL,37℃增菌過夜后(突發疫情時先增菌1h,挑取部分上層增菌液進行熒光定量PCR檢測,其余繼續增菌過夜),挑取以上樣本的上層增菌液進行熒光定量PCR檢測和傳統細菌培養;同時取2～3滴轉種于10mL堿性蛋白胨水中作第2次增菌,37℃增菌6h后再進行熒光定量PCR檢測和傳統細菌培養。1.8.2 外環境樣本DNA提取 將增菌后的堿性胨水混勻,吸取10mL至15mL離心管中,1 000r/min離心10min,吸取1mL上層液體經4 000r/min離心10min,收集沉淀,加 100μL DEPC水重懸,煮沸10min,10 000r/min離心,取上清,-80℃保存備用。

2 結 果

2.1 雙重熒光定量PCR的特異性 對O1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧菌、創傷弧菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、甲型副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、奇異變形桿菌、大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌分別提取核酸,采用霍亂弧菌TaqMan雙重熒光定量PCR反應系統進行檢測,除O1群霍亂弧菌顯示CT、rfbO1基因均陽性,O139群霍亂弧菌顯示CT基因陽性外,其它所有細菌的檢測結果均陰性。說明該體系具有高度特異性。

2.2 雙重熒光定量PCR的檢測靈敏度 O1群霍亂弧菌定量后(OD492nm=0.1,相當于1.0×107cfu/mL)[6],將其稀釋至 1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101cfu/mL,提取細菌DNA,平行進行單重熒光定量 PCR與雙重熒光定量PCR反應,比較其靈敏度。結果雙重熒光定量PCR對O1群霍亂弧菌rfbO1基因、CT基因檢測靈敏度均達到了1.0×102cfu/mL,與單重熒光定量PCR檢測rfbO1基因、CT基因靈敏度相當。見圖1和圖2。

圖1 雙重、單重熒光定量 PCR檢測O1群霍亂弧菌rfbO1基因靈敏度比較注:曲線A和B,C和D,E和 F,G和 H,I和J分別表示雙重和單重熒光定量 PCR方法檢測相同濃度O1群霍亂弧菌 rfbO1基因,核酸濃度依次為 106、105、104、103、102cfu/mL,101cfu/mL與陰性對照均未出峰Fig.1 Sensitivity for detection of rfb-O1 gene for Vibrio cholerae serogroup O1 with multiplex real-time PCR and real-time PCR.Note:106-102cfu/mL from left to right and 101cfu/mL is negative.

圖2 雙重、單重熒光定量PCR檢測O1群霍亂弧菌CT基因靈敏度比較注:曲線A和B,C和D,E和 F,G和 H,I和J分別表示雙重和單重熒光定量 PCR方法檢測相同濃度O1群霍亂弧菌CT基因,核酸濃度依次為106、105、104、103、102cfu/mL,101cfu/mL與陰性對照均未出峰Fig.2 Sensitivity for detection of CTgene forVibrio cholerae serogroup O1 with multiplex real-time PCR and realtime PCR.Note:106-102cfu/mL from left to right and 101cfu/mL is negative.

2.3 雙重熒光定量PCR標準曲線的建立 以已知霍亂弧菌濃度為橫坐標,以PCR反應循環數為縱坐標,可以得到細菌相對定量標準曲線。rfbO1基因、CT基因標準曲線相關系數分別為0.999和0.998,提示雙重熒光定量PCR反應檢測體系檢測不同濃度的細菌核酸均具有理想的效果。

圖3 雙重熒光定量PCR檢測O1群霍亂弧菌rfbO1基因、CT基因標準曲線Fig.3 Standard curves of the CTand rfb-O1 gene for Vibrio cholerae serogroup O1 detected by the multiplex realtime PCR

2.4 雙重熒光定量PCR應用于外環境樣本監測中我們利用建立的雙重熒光定量 PCR檢測方法對2008年4-11月份所采集的352件外環境樣本進行了檢測,同時與傳統細菌培養法進行比較,共檢測出5株帶毒力基因的O1群霍亂弧菌。如表3和圖4所示。

表3 2008年4-11月采集352份外環境樣本中檢出5株O1群霍亂弧菌情況Table 3 Five strains of toxigenic Vibrio cholerae serogroup O1 were collected from 352 environmental specimens from Apr.to Nov.2008

利用傳統細菌培養法進行檢測,5份陽性標本中只有1份在1次、2次增菌中均分離到O1群霍亂弧菌,其余4份均只在2次增菌中分離到,這可能與監測樣本本身含菌量少有關。而我們利用所建立的雙重熒光定量PCR法進行檢測,這5份標本均在1次、2次增菌中同時檢測出霍亂弧菌,這就在很大程度上避免了漏檢,有效防止假陰性結果的發生。

3 結 論

圖4 雙重熒光定量PCR對部分外環境樣本中O1群霍亂弧菌的檢測注:帶符號“●”、“▲”分別表示霍亂弧菌 rfbO1、CT基因Fig.4 Detection of toxigenic Vibrio cholerae serogroup O1 from environmental specimens by multiplex real-time quantitative PCR

目前熒光定量PCR技術以其靈敏度高,檢測速度快,特異性強等優點,已在許多病原微生物的診斷中發揮了巨大作用。本研究組近年建立的單重熒光定量快速檢測霍亂弧菌方法,也在疫情的應急診斷中得到運用,并取得較好效果[7]。在此基礎上分別在rfbO1基因序列檢測上采用 HEX標記的熒光探針,在CT基因序列檢測上采用ROX標記的熒光探針,組合成雙重熒光定量PCR檢測體系,應用美國Stratagene公司Mx3000P型熒光定量 PCR儀進行雙通道熒光檢測與鑒定分型,實現一管雙檢,即可判斷出是否帶毒力基因,又可有效區分出是否為O1群霍亂弧菌,大大簡化了實驗過程,節省了實驗試劑?；魜y弧菌雙重熒光定量PCR快速診斷分型對控制疫情蔓延發展和制定及時防控策略具有重要意義。

本研究建立的方法不僅能夠最快在3 h內準確地鑒定出是否為帶毒力基因的O1群霍亂弧菌,而且與傳統培養法和普通PCR法相比具有更高的靈敏度。我們以往研究的單重熒光定量PCR檢出限可達到1.0×102cfu/mL,本研究建立的雙重熒光PCR也可以達到單重熒光法的最低檢出限。研究建立的雙重熒光PCR定量標準曲線相關系數分別達到0.999和0.998,說明此反應體系穩定性強,具有較高的準確度。

本研究建立的快速、靈敏、準確的雙重熒光定量PCR分型檢測技術,可應用于外環境樣本中O1群霍亂弧菌的大范圍篩查,對霍亂疫情的預防及控制和流行病學監測具有重要價值。

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[6《]霍亂防治手冊》編寫組.霍亂防治手冊[M].5版.中華人民共和國衛生部疾病控制司,1999:10.

[7]徐丹戈,黃世旺,盧亦愚,等.實時熒光定量聚合酶鏈反應法與常規聚合酶鏈反應法及傳統培養法檢測霍亂弧菌的比較[J].中國預防醫學雜志,2007,8(增刊):54-56.