順鉑誘導的人胃癌耐藥細胞BGC-823/CDDP的建立

王 攀,王崇樹,魏壽江,王 城,侯華芳

(川北醫學院附屬醫院普外科,四川南充 637000)

順鉑誘導的人胃癌耐藥細胞BGC-823/CDDP的建立

王 攀,王崇樹△,魏壽江,王 城,侯華芳

(川北醫學院附屬醫院普外科,四川南充 637000)

目的建立人胃癌順鉑(CDDP)耐藥細胞(BGC-823/CDDP細胞)并研究其生物學特征。方法采用體外逐步增加順鉑藥物濃度反復間歇誘導法建立BGC-823/CDDP細胞系,并對其產生耐藥的特點、光鏡形態、超微結構、生長特點、細胞周期進行研究,用四甲基偶氮唑鹽(M TT)法檢測其藥物敏感性。結果BGC-823/CDDP細胞系生物學特征較親代細胞發生了變化。BGC-823/CDDP細胞系體積較親代細胞稍大,并有巨核細胞,透射電鏡觀察細胞表面微絨毛明顯減少。BGC-823/CDDP細胞較親代細胞的倍增時間延長了4.3 h。細胞周期分布:S期細胞輕度減少;而G0/G1和G2/M期細胞較親代細胞輕度增多;與親代細胞比較,BGC-823/CDDP細胞對CDDP的耐藥倍數為11.35倍,對絲裂霉素C(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)分別為4.85、5.29、10.07倍,表明其具有交叉耐藥性。結論本實驗成功建立了BGC-823/CDDP細胞系,為下一步實驗研究奠定了基礎。

順鉑;藥物耐受性;胃癌細胞系

胃癌是消化道常見惡性腫瘤之一,目前其5年生存率不超過30%[1],臨床上采用多藥聯合化療方案,即以最低的藥物濃度,最小的毒性反應來達到提高臨床療效的目的,但其臨床療效不甚理想,總有效率約為40%～50%[2]。目前順鉑(CDDP)及其他鉑類制劑作為胃癌化療的常用藥物,但近年來臨床治療發現越來越多的患者對其耐藥而導致化療失敗[3]。究其根本原因可能是腫瘤細胞對化療產生的多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)。本研究通過建立人胃癌的CDDP耐藥細胞系,研究胃癌CDDP耐藥細胞的生物學特征及耐藥譜。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑 羥喜樹堿注射液(HCPT,湖北黃石飛云制藥有限公司)、CDDP(山東德州制藥有限公司)、絲裂霉素C(MMC,浙江海正藥業股份有限公司)、5-氟尿嘧啶(5-FU,湖北黃石飛云制藥有限公司)、阿霉素(ADM,湖北黃石飛云制藥有限公司)、長春新堿(VCR,湖北黃石飛云制藥有限公司)、RPM I-1640(Gibco公司)、小牛血清(成都哈里生物工程有限公司)、四甲基偶氮唑鹽(M TT,Sigma公司)等。

1.2 細胞株與細胞培養 人胃癌細胞系BGC-823由重慶醫科大學病理生理教研室提供。用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液培養細胞,并置于37℃、5%CO2培養箱中孵育。

1.3 耐藥細胞系的建立 采用逐步增加藥物劑量的方法誘導[4]:細胞處于對數生長期時,加入CDDP藥液使其終濃度為0.025μ g/mL,作用48 h后,傾去含藥培養液,加入新鮮培養液繼續培養,當細胞生長至80%～90%匯合狀態,反復按上述方法傳代,直至細胞能在含藥培養液中穩定生長。逐步增加CDDP誘導濃度,歷時6個多月,最終獲得了能在0.60 μ g/mL的CDDP含藥培養液中穩定生長的胃癌耐藥細胞,并能反復傳代生長良好。

1.4 M TT法檢測BGC-823細胞和BGC-823/CDDP細胞的藥物敏感性 取對數生長期細胞以2.0×104/mL接種于96孔板內,每孔200 μ L。實驗設空白對照組(不含細胞)、細胞對照組(不加藥物)和藥物實驗組。藥物實驗組加入按一定比例稀釋成5種濃度的以上抗癌藥物各20 μ L,每一濃度設3個重復孔,置于37℃、CO25%及飽和濕度的細胞培養箱孵育68 h后,加入無血清的 RPMI-1640培養液 200 μ L及 5 mg/mL的MTT 20 μ L,繼續培養 4 h,加入二甲亞砜(DMSO)200微升/孔,用自動酶標儀在570 nm處測定每孔的吸光度(A值)。每組實驗重復3次,取其平均值。根據A值計算細胞存活率,計算公式為:細胞存活率(%)=藥物實驗組A值/細胞對照組A值×100%。由藥物濃度的對數值與其線性回歸求出各藥物的半數抑制濃度(IC50)。然后根據IC50求出耐藥指數(RI)=IC50(耐藥細胞)/IC50(親代細胞)。

1.5 細胞形態觀察 光鏡觀察:將5.0×104/mL單細胞懸液接種于內鋪玻片24孔板中,2毫升/孔,于培養箱中孵育72 h后,用1∶3冰醋酸/甲醇固定細胞30 min,37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次,采用HE染色法,中性樹膠封片,光鏡下觀察和照相。透射電鏡觀察:胰酶消化對數生長期細胞,依次加入4%戊二醛和1%四氧鋨酸固定細胞,常規電鏡制片,鈾鉛雙重染色后透射電鏡觀察、照相。

1.6 細胞生長曲線和倍增時間測定 取細胞濃度為3.0×104/mL的單細胞懸液各2 mL,分別接種于15 mL細胞培養瓶內,共21瓶,從第2天起,每天記數3瓶取其平均值,共7 d。按公式計算細胞倍增時間(doubling time,TD),TD=T×log2/(logNt-LogN0)(N0為初始細胞數,Nt為終末細胞數,T為Nt～N0的時間)。

1.7 流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期分布 收集1×106/mL細胞,用冰PBS液洗滌2次,70%乙醇固定過夜,將等體積的細胞懸液和碘化丙啶染液混合,將樣品放入 FCM的樣品室。

1.8 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件,計量資料以±s表示,組間比較采用 t檢驗,計數資料采用 χ2檢驗,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BGC-823/CDDP細胞的建立 采用藥物濃度遞增法,歷時6個多月,藥物濃度從0.025 μ g/mL開始,最終獲得了一株能在0.60 μ g/mL的CDDP含藥培養液穩定生長的胃癌耐藥細胞株,命名為BGC-823/CDDP細胞株。在耐藥誘導中,12周前,細胞增殖緩慢,死亡細胞較多,細胞對化療藥物的敏感性較高,藥物濃度的增加較慢;13周后,細胞增殖速度較快,藥物濃度的增幅變大,最終能在0.60 μ g/mL的CDDP含藥培養液中穩定生長。

2.2 BGC-823細胞和BGC-823/CDDP細胞的藥物敏感性BGC-823/CDDP細胞對CDDP的耐藥指數為11.35,對MMC、5-FU、ADM有不同程度的耐藥性,HCPT、VCR無明顯耐藥性,表明BGC-823/CDDP細胞具有交叉耐藥性,見表1。

2.3 細胞形態觀察 光鏡下BGC-823細胞呈圓梭形,細胞大小一致,細胞核呈圓形,大小一致;BGC-823/CDDP細胞大小不一致,形態不規則,細胞體積略大于BGC-823細胞,并出現核巨細胞,其細胞核有融合現象。透射電鏡觀察BGC-823/CDDP與BGC-823細胞相比,其細胞表面微絨毛較親代細胞明顯減少,變短,線粒體明顯腫脹,見圖 1、2。

表1 BGC-823細胞與BGC-823/CDDP細胞的藥物敏感性比較

圖1 BGC-823細胞電鏡觀察(×6 000)

圖2 BGC-823/CDDP細胞電鏡觀察(×6 000)

2.4 細胞生長曲線和倍增時間測定 BGC-823細胞和BGC-823/CDDP細胞的倍增時間分別為(45.1±2.2)h和(49.4±3.1)h,兩者比較差異有統計學意義(P＜0.05),二者生長曲線形態相似,BGC-823/CDDP細胞的倍增時間較BGC-823細胞輕度延長。

2.5 細胞周期分布 BGC-823細胞與BGC-823/CDDP細胞比較有一定差異,BGC-823/CDDP細胞S期細胞輕度減少(P＜0.05);而G0/G1和G2/M期細胞輕度增多(P＜0.05)。

3 討 論

對惡性腫瘤患者而言,化療是重要的綜合治療措施之一,然而腫瘤細胞對化療藥物的耐藥是治療失敗的重要原因。不同類型的腫瘤天然對許多化療藥物耐藥,此外,部分腫瘤逐漸對化療藥物產生獲得性耐藥[5-6],而后者為近年來研究的熱點之一,它包括典型多藥耐藥和非典型多藥耐藥兩種,前者伴隨著P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的合成,而后者由幾種不同的和一些未知的機制所介導[7-9]。

有研究發現,MDR表型在體外能被暴露在高濃度的藥物中所誘導變化[10],體外建立耐藥細胞株的方法主要有4種,即逐漸增加藥物劑量法[4]、間歇大劑量法[11]、逐漸增加劑量與間歇大劑量相結合法[12]和細胞內藥物注射法[13]。本實驗采用抗癌藥物CDDP與人胃癌細胞長期接觸培養,采用逐漸增加藥物劑量的方法,成功建立了人胃癌CDDP耐藥細胞,命名為BGC-823/CDDP細胞。本研究發現在開始1～12周的誘導期間內,細胞形態基本恢復正常,開始分裂所需時間較長;而在誘導超過12～25周,細胞雖然經過更高濃度的藥物作用但其恢復至正常所需的時間逐漸縮短,產生該現象的原因可能與在耐藥誘導過程中腫瘤細胞的耐藥性不斷增強、耐藥相關基因的表達量增加有關[14-15]。真核細胞的周期有兩個基本事件:S期進行染色體的復制,M期將復制了的染色體分配到兩個子代細胞中去。在這兩個基本事件之前,均有一段間隙期,分別為G1和G2期,不同的細胞存在著一定的差異,為此,檢測了兩種細胞的細胞周期,發現二者的細胞周期有一定的變化,BGC-823/DDP細胞S期細胞輕度減少,而G0/G1和G2/M期細胞輕度增加,但差別不大,表明BGC-823/CDDP細胞并沒有因為CDDP的作用而明顯抑制其生長,能夠在含CDDP的環境中長期而穩定的生長。BGC-823細胞和BGC-823/CDDP細胞的倍增時間分別為45.1 h和49.4 h,差異有統計學意義(P＜0.05),其他研究者也得出了類似的結論[16]。

MTT法是近年來實驗研究以及臨床上廣泛采用的體外藥敏試驗方法,本實驗采用M TT法檢測了BGC-823細胞和BGC-823/CDDP細胞的藥物敏感性,發現二者對藥物的敏感性存在較大的差異,BGC-823/CDDP細胞對 CDDP、MMC、5-FU、ADM 的耐藥性分別為 BGC-823細胞的11.35、4.85、5.29、10.07倍,表明其具有交叉耐藥性,即具有MDR表型,可用于下一步實驗研究。

[1]Wanebo HJ,Kennedy BJ,Chmiel J,et al.Cancer of the stomach.A patient case study by the America colledge of surgeons[J].Ann Surg,1993,218:583-592.

[2]Hanazaki K,Mochizuki Y,Kachida T,et al.Post-operative chemotherapy in non-curative gastrectomy for advanced gastric cancer[J].Hepatogastoenterology,1999,46(26):1238-1243.

[3]Chun JH,Kim HK,Lee JS,et al.Weekly irinotecan in patients with metastatic gastric cancer failing cisplatin-based chemotherapy[J].Jpn J Clin Oncol,2004,34(1):8-13.

[4]Yu DS,Ma CP,Chang SY.Establishment and characterization of renal cell carcinoma cell lines with multidrug resistance[J].Urol Res,2000,28(2):86-92.

[5]Branimir IS.Natural and acquired resistance to cancer therapies[J].The Molecular Basis of Cancer,2008:583-592.

[6]Peter D,Ruhong L,Rainer S,et al.Cancer drug resistance:The central role of the karyotype[J].Drug Resist Update,2007,10(1):51-58.

[7]Tomris O.Mechanisms and strategies to overcome multiple drug resistance in cancer[J].FEBS Lett,2006,580(12):2903-2309.

[8]Lara SJM,Lilian E,Van V,et al.Multi-functional nano carriers to overcome tumor drug resistance[J].Cancer Treat Rev,2008,34(7):592-602.

[9]David J,Conkey M,Keyi Z.Mechanisms of proteasome inhibitor action and resistance in cancer[J].Drug Resist Update,2008,11(4):164-179.

[10]Schondorf T,Kurbacher CM,Gohring UJ,et al.Induction of MDR1-gene expression by antineoplastic agents in ovarian cancer cell lines[J].Anticancer Res,2002,22(4):2199-2203.

[11]陳杰,錢桂生,黃桂君,等.人肺腺癌多藥耐藥細胞系的建立及生物學特征[J].第三軍醫大學學報,2001,73(7):135-137.

[12]李曦,郭先健,黃桂君,等.人肺腺癌多藥抗癌細胞系Lc-3/CDDP細胞周期及DNA含量變化[J].河南腫瘤學雜志,1997,10(2):93.

[13]Tesstsya S,Ken II,Masa JY,et al.Establishment of drug resistant in human gastric and colon carcinoma xenograft lines[J].Jpn J Cancer,1991,82(5):593-599.

[14]Daniel SM,Douglas DT,Cicek GT.Induction of p53 and drug resistance following treatment with cisplatin or paclitaxel in ovarian cancer cell lines[J].Cancer Lett,2006,236(2):302-308.

[15]王治偉,楊強,趙渝.腫瘤多藥耐藥的生化及分子機制[J].重慶醫學,2008,37(5):543-544.

[16]Victoria S,Martin GR,Elaine B,et al.Establishment and characterization of acquired resistance to the farnesyl protein transferase inhibitor r115777 in a human colon cancer cell line[J].Clin Cancer Res,2002,8(6):2002-2009.

Establishment of cistplatin-resistant BGC-823/CDDP cells

Wang Pan,Wang Chongshu△,Wei Shoujiang,Wang Chen,Hou Huafang
(Department of General Surgical,the A f filiated Hospital,North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan 637000,China)

ObjectiveTo establish a cisplatin-resistant cell line from human gastric cancer cell,and study its biological characteristics.MethodsA cisplatin-resistant human gastric cancer cell line(BGC-823/CDDP)was induced by continuously exposing and gradually increasing dose of cisplatin,and the morphological feature,ultrastructure and growth characteristics were examined.The cell cycle distribution of the two cell lines was determined by flow cytometry(FCM).The drug sensitivity was measured by M TT assay.ResultsThe biological properties of BGC-823/CDDP cell line had changed compared with the parent BGC-823 cell,and the volume of BGC-823/CDDP cells with macronucleus cells was slightly larger than that of the latter.Under transmission electronmicroscopy,the microvillus of BGC-823/CDDP cells significantly decreased.The population double time was 4.3 h longer than the parental cell line BGC-823.Compared with BGC-823 cells,BGC-823/CDDP cells had faintly lower fraction of cell cycle distribution in S phase and higher in G0/G1and G2/M phase.By M TT assay,the resistance index of BGC-823/CDDP cells to cisplatin was 11.35 and it also showed cross-resistance to mitomycin C(MMC),5-fluorouracil(5-FU)and adriamycin(ADM),the resistance indexes were 4.85,5.29 and 10.07,respectively.ConclusionBGC-823/CDDP is established.It can be used for further experiments.

cisplatin;drug resistance;gastric cancer cell line

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.04.004

A

1671-8348(2011)04-0323-03

△通訊作者,Tel:15328899583;E-mail:chongs-wang@163.com。

2010-03-18

2010-08-09)

·醫學教育·