Caveolin-1蛋白及mRNA在食管鱗狀細胞癌組織中的表達

楚廣民,龐 霞,高冬玲

(1.河南省腫瘤醫院病理科,鄭州 450008;2.鄭州大學第一附屬醫院病理科/河南省腫瘤病理重點實驗室 450052)

Caveolin-1蛋白及mRNA在食管鱗狀細胞癌組織中的表達

楚廣民1,龐 霞2,高冬玲2

(1.河南省腫瘤醫院病理科,鄭州 450008;2.鄭州大學第一附屬醫院病理科/河南省腫瘤病理重點實驗室 450052)

目的探討窖蛋白1(Caveolin-1)蛋白及mRNA在食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中的表達及其意義。方法應用免疫組織化學及原位雜交方法檢測57例ESCC組織、34例癌旁不典型增生組織及57例正常食管黏膜組織中Caveolin-1蛋白及mRNA的表達。結果ESCC組織、癌旁不典型增生組織及正常黏膜組織中Caveolin-1蛋白的陽性表達率依次降低,分別為54.4%(31/57)、38.2%(13/34)和19.3%(11/57),組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05);ESCC組織、癌旁不典型增生組織及正常黏膜組織中Caveolin-1 mRNA的陽性表達率依次降低,分別為64.9%(37/57)、47.1%(16/34)和 22.8%(13/57),組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05);Caveolin-1蛋白及mRNA的表達均與ESCC的分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移密切相關(P＜0.05)。結論Caveolin-1蛋白及mRNA表達與ESCC的發生、發展和轉移密切相關,可作為ESCC的一種標記物,聯合檢測Caveolin-1蛋白及mRNA在評估ESCC預后方面具有一定的臨床價值。

窖蛋白1;腫瘤,鱗狀細胞;免疫組織化學;原位雜交

窖蛋白1(Caveolin-1)是細胞膜上的一種支架蛋白,參與腫瘤形成和侵襲轉移等多種生物功能[1-3]。目前,對Caveolin-1在腫瘤發生、發展過程中的作用存在爭議,為了探討Caveolin-1在食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中的作用,作者采用免疫組織化學及原位雜交方法,聯合檢測了Caveolin-1蛋白及mRNA在ESCC組織中的表達,為ESCC診斷和治療提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 57例ESCC患者來自河南省腫瘤醫院,其中男32例,女 25例,年齡31～72歲,所有病例術前均無化療、放療及免疫治療史。所有標本分別在無壞死癌灶、癌旁3 cm以內及遠端正常黏膜組織處取材,經40 g/L多聚甲醛固定,常規脫水,石蠟包埋,連續切片,切片厚度 4～ 6 μ m,分別用于 HE、免疫組織化學及原位雜交染色。經HE染色病理組織學證實,癌灶組織均為ESCC。按 WHO分類標準(1996)進行組織學分級:高分化11例,中分化27例,低分化19例。浸潤至肌層20例,浸潤到外膜及鄰近組織37例;伴淋巴結轉移者39例,無淋巴結轉移者18例。癌旁組織中34例為不典型增生。遠端正常黏膜組織均為正常食管黏膜。

1.2 主要試劑 Caveolin-1兔抗人多克隆抗體為Santa Cruz產品,稀釋度為1∶400。SP免疫組織化學試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發公司。Caveolin-1 mRNA原位雜交試劑盒購自Clontech公司。

1.3 免疫組織化學染色 采用SP法檢測,DAB顯色,蘇木素復染,詳細步驟嚴格按SP試劑盒說明書操作,每批實驗同時設立陽性和陰性對照,用已知陽性切片作為Caveolin-1蛋白的陽性對照,以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4 原位雜交染色 標本經新鮮配制二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水后,用新鮮配制的0.5%H2O2室溫處理30 min,以滅活內源性過氧化物酶;3%檸檬酸新鮮配制蛋白酶(0.01 g/L),37℃處理10 min,消化標本DNA結合蛋白;每張玻片滴加20μ L不含探針的預雜交液(42℃),預雜交 4 h;加含探針(1 ng/L)的雜交液,42℃濕盒內雜交12 h;用標準檸檬酸鹽(SSC)42℃清洗后,加SA-Bio-AP 37℃處理10 min;漂洗后加 BCIP/NBT,避光顯色2～4 h。以不含探針的標本作陰性對照。

1.5 結果判定 Caveolin-1蛋白呈棕黃色主要定位于細胞質,Caveolin-1 mRNA呈紫藍色定位于細胞質內。結果判斷如下:高倍鏡下隨機選取5個視野(每個視野觀察細胞數不少于200個),按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結果判定[4-5]。采用9分評分制,按照陽性細胞比例:≤10%為 1分,＞10%～50%為 2分,＞50%為3分;按染色強弱:無黃(藍)色為0分;淡黃(藍)色為1分;中度黃(藍)色為 2分,棕黃(紫藍)色為3分。然后按照“陽性細胞比例分數乘以染色強弱得分”計總分,總分小于3為陰性,≥3為陽性。

1.6 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件進行統計學處理,采用χ2檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Caveolin-1蛋白在ESCC組織中的表達 Caveolin-1蛋白主要存在于癌組織細胞質中,呈淺黃色至深黃色,見封2圖1。Caveolin-1蛋白在ESCC組織、癌旁不典型增生組織及正常黏膜組織中的陽性表達率依次降低,組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05,見表 1。Caveolin-1蛋白表達均與ESCC的分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移相關(P＜0.05),見表2。

表1 Caveolin-1蛋白及mRNA在各種組織中的陽性表達率[n(%)]

表2 Caveolin-1蛋白及mRNA表達與ESCC臨床參數的關系[n(%)]

表2(續) Caveolin-1蛋白及mRNA表達與 ESCC臨床參數的關系[n(%)]

2.2 Caveolin-1 mRNA在ESCC組織中的表達 Caveolin-1 mRNA主要存在于癌組織細胞質中,呈藍紫色,見封2圖2。Caveolin-1 mRNA在ESCC組織、癌旁不典型增生組織及正常黏膜組織中的陽性表達率依次降低,組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05),見表1。Caveolin-1 mRNA表達均與 ESCC的分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移相關(P＜0.05),見表2。

3 討 論

Caveolas是一種非包被的細胞囊/小泡,以胞膜小窩、胞膜穴樣內陷兩種形式單獨或成簇存在于多種細胞表面,其直徑為50～100 nm,是各種信號分子和信號通路的“整合器”,是細胞膜生物功能的重要結構基礎[6-8]。Caveolin-1是Caveolas的標記性蛋白,相對分子質量為21～24 kD,其編碼基因定位于人染色體7q 31.1,有3個外顯子,不但參與了 Caveolas的形成,以及細胞增殖、分化、凋亡和血管生成的信號通路的調控,而且與腫瘤的發生、發展和轉移有密切關系[9-11]。Caveolin-1在腫瘤中的表達有所爭議,許多學者發現在乳腺癌[12]、肺癌[13]、膀胱癌[14]等組織中Caveolin-1高表達,并與浸潤、轉移有密切關系。但也有跡象表明Caveolin-1在腫瘤中有表達缺失,與腫瘤的抑制有關[15]。

本實驗結果顯示,Caveolin-1 mRNA及其蛋白在ESCC組織、正常黏膜組織和不典型增生組織中均有表達,但在ESCC組織中的表達水平顯著增高。表明Caveolin-1在ESCC組織中無論轉錄水平還是蛋白水平均有表達上調,提示Caveolin-1的異常表達可能與ESCC的發生、發展密切相關;Caveolin-1 mRNA及其蛋白的表達均與腫瘤的分化程度有關,提示Caveolin-1的表達對ESCC惡性程度的評估有一定的價值;其mRNA及其蛋白的表達在浸潤深度和淋巴結轉移中具有明顯差異,表明Caveolin-1的異常表達與食管癌的浸潤、轉移密切相關,這與 Kato等[16]的分析結果一致。

總之,Caveolin-1蛋白及mRNA與ESCC的發生、發展和轉移密切相關,二者表達可作為ESCC診斷和治療的生物學指標,但Caveolin-1在腫瘤中的作用機制目前尚不清楚,有待進一步深入研究。

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Expression of Caveolin-1 protein and mRNA in esophageal squamous cell carcinoma tissue

Chu Guangmin1,Pang Xia2,Gao Dongling2
(1.Department of Pathology,Henan Province Tumor Hospital,Zhengzhou,Henan 450008,China;2.Department of Pathology,Henan Key Laboratory of Tumor Pathology/the First Af filiated Hospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan 450052,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of Caveolin-1 protein and mRNA in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)tissues and its significance.MethodsThe expressions of Caveolin-1 protein and mRNA was detected by immunohistochemistry and in situ hybridization methods in 57 cases of ESCC tissues,34 cases of adjacent atypical hyperplasia epithelial tissues and 57 cases of normal esophageal epithelial tissues.ResultsThe positive expression rate of Caveolin-1 protein gradually decreased from 54.4%(31/57)in ESCC,38.2%(13/34)in adjacent atypical hyperplasia epithelium to 19.3%(11/57)normal esophageal epithelium specimens,and there was a significant statistic difference among the groups(P＜0.05).Additionally,the expression rates of Caveolin-1 mRNA decreased by turns from ESCC,adjacent atypical hyperplasia epithelium to normal esophageal epithelium specimens,which were 64.9%(37/57),47.1%(16/34)and 22.8%(13/57)respectively,and there was a significant statistic difference among the groups(P＜0.05).The expressions of Caveolin-1 protein and mRNA were closely correlated with the different differentiation levels,infiltrative depth and lymph node metastasis in ESCC tissues(P＜0.05).ConclusionThe expressions of Caveolin-1 protein and mRNA may play important roles in the infiltration,metastasis and carcinogenesis of ESCC,suggesting it may be used as a tumor maker of ESCC.Combined detections of Caveolin-1 protein and mRNA have some clinical value in assessing the prognosis of ESCC.

Caveolin-1;carcinoma,squamous cell;immunohistochemistry;in situ hybridization

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.04.006

A

1671-8348(2011)04-0328-03

2010-02-21

2010-08-17)

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