椎間盤退變過程中軟骨終板AQP3的表達變化

曹國永,楊渝勇,蔣 勇,龍 毅,李 杰,周 躍

(1.武警重慶總隊醫院骨科 400061;2.第三軍醫大學新橋醫院骨科,重慶 400037)

椎間盤退變過程中軟骨終板AQP3的表達變化

曹國永1,楊渝勇1,蔣 勇1,龍 毅1,李 杰1,周 躍2△

(1.武警重慶總隊醫院骨科 400061;2.第三軍醫大學新橋醫院骨科,重慶 400037)

目的闡明水通道蛋白3(AQP3)在椎間盤退變時表達變化特點及其與椎間盤退變的相關性。方法建立大鼠椎間盤退變的動物模型,影像學觀察模型建立的可靠性,采用RT-PCR的方法檢測AQP3 mRNA表達的變化,Western blot進行AQP3蛋白的檢測。結果成功建立了大鼠椎間盤退變模型,AQP3 mRNA和蛋白的表達隨椎間盤退變的進程進行性下降,術后3個月時同術前相比明顯下降(P＜0.05),術后6個月和9個月則下降更為明顯(P＜0.01)。結論AQP3參予了椎間盤退變的發生、發展,AQP3表達下降可能是椎間盤退變的原因之一。

椎間盤;軟骨;水通道蛋白質3

椎間盤退變是引起下腰痛的主要原因之一,椎間盤退變的病理生理機制現在仍不甚明了。但其中一個重要的可能機制是椎間盤營養供應的下降[1],終板對椎間盤的營養供給和水化狀態的維持有重大的影響[2]。營養物的滲透率與終板的水化程度密切相關,含水越多,滲透率越高,滲透速度越快。椎間盤退變時由于終板的鈣化,營養物的滲透率下降,加重了退變的程度。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是轉運水分子和甘油的特異通道蛋白,研究表明AQP3在軟骨終板上有表達,可能參與了椎間盤退變的進程[3]。本研究就椎間盤退變過程中AQP3的表達變化規律進行分析,探討其在椎間盤退變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 正常SPF級成年SD大鼠35只,雌雄不拘,體質量130～150 g。用隨機數字表法分為假手術組(15只),模型組(15只),術前對照組(5只)。由第三軍醫大學動物實驗中心提供。

1.2 椎間盤退變動物模型制作 予3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射,麻醉成功后,將動物俯臥于手術臺上,四肢固定。腰背部備皮,碘酒乙醇消毒腰背部,鋪洞巾。模型組背部正中縱向切口,依次切開皮膚、皮下組織及腰背筋膜,沿棘突兩側剝離骶棘肌并向兩側分開,顯露 L1～6棘突,切除,暴露雙側椎板、關節突,切除 L1～6的小關節外1/2部分,切斷椎板間韌帶。假手術組僅切開皮下組織,術后逐層縫合傷口。

1.3 X線檢測及標本取材 于術后3、6、9個月分別對各組大鼠進行X線檢測,以觀察模型建立的可靠性,各時間點分取5只大鼠進行檢測。檢測完畢后,在無菌條件下取出 L3、L4、L5的椎間盤組織,含完整的軟骨終板,以無菌生理鹽水洗去表面附著的血污,并切除軟骨終板上的多余椎體組織,然后立即置于液氮中凍存備用。

1.4 RT-PCR檢測AQP3 mRNA的表達 標本取出后于研缽中加入液氮磨碎,加入1 mL T ripure分離試劑(Roch公司),按說明書操作。所得的 RNA用于下一步的RT-PCR。大鼠AQP3 mRNA全長序列從 Gene Bank查得,使用DNA-star軟件進行 PCR引物設計,引物序列如下:5′-TGG GCC T TG TGG TCC TGG TCA TTG-3′;5′-GGG GTG GAT ACA GGG AGC GT T TT T-3′,退火溫度57℃,擴增片斷長度為426 bp。內參采用 GAPDH,5′-TGC TGA GTA TGT CGT GGA GT-3′;5′-AGT CTT CTG AGT GGA AGT GAT-3′, 退火 溫 度53℃,擴增片斷長度為289 bp。上述引物交由北京升博生物公司合成。每管反應體積20μ L。反轉錄:室溫放置10 min,42℃60 min,95℃10 min,4℃5 min。PCR擴增:94℃預變性4 min,94℃預變性50 s,51℃復性45 s,72℃延伸60 s,擴增30個循環,72℃延伸10 min,4℃保存。取5 μ L PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,5 V/cm,60～90 min,在凝膠成像系統上進行灰度值測定。

表1 AQP3 mRNA在大鼠軟骨終板中的表達( ±s,IOD值,n=5)

表1 AQP3 mRNA在大鼠軟骨終板中的表達( ±s,IOD值,n=5)

*:P＜0.05,**:P＜0.01,與同組術前比較;△:P＜0.05,與同期假手術組比較。

組別 術前 術后3個月 術后6個月 術后9個月假手術組 0.296 7±0.011 0 0.289 2±0.010 6 0.270 3±0.011 2* 0.217 4±0.005 8*模型組 0.296 7±0.011 0 0.280 2±0.009 8* 0.211 2±0.010 2**△ 0.143 6±0.009 6**△

表2 AQP3蛋白在大鼠軟骨終板中的表達( ±s,IOD值,n=5)

*:P＜0.05,**:P＜0.01,與同組術前比較;△:P＜0.05,與同期假手術組比較。

組別 術前 術后3個月 術后6個月 術后9個月假手術組 0.514 5±0.013 0.500 1±0.010 0.491 9±0.008* 0.440 9±0.019*實驗組 0.514 5±0.013 0.491 2±0.013* 0.420 4±0.013**△ 0.360 0±0.018**△

1.5 Western blot檢測AQP3蛋白的表達 標本取出后于研缽中加入液氮磨碎,加入組織裂解液冰上裂解30 min;4℃、20 000×g離心 30 min;吸取上清液分裝,-20℃保存。用Bradford比色法測定蛋白質濃度。10%SDS-PAGE電泳,每孔加樣50 μ L。電泳結束后,將蛋白轉至PVDF膜上,封閉1 h后,加入兔抗AQP3多克隆抗體(1∶400,Santa Cruz),4℃過夜孵育;TBST洗膜,加入二抗(辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG,1∶2 000,封閉液稀釋),37℃1 h;TBST洗膜,DAB顯色。內參GAPDH的檢測方法同上,其一抗的稀釋度為1∶400。

1.6 圖像處理 以GhemilmagerTM凝膠成像系統對條帶進行掃描和圖像存儲,以Image Pro Plus圖像處理系統進行圖像分析,分別計算目的條帶和內參條帶的積分光密度(IOD)值,結果以AQP3/GAPDH的IOD比值表示。

1.7 統計學處理 應用SPSS10.0統計軟件進行數據統計學處理。采用單因素方差分析,結果以±s表示,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 模型制作結果 模型組于術后3、6個月即出現椎間隙的楔形改變,于術后 9 個月可見 L2～3、L3～4、L4～5多個椎間隙狹窄,見圖1。而假手術組則無明顯的椎間隙狹窄征象。

圖1 術后9個月X線檢測

2.2 AQP3 mRNA和蛋白的表達變化 模型組術后3個月AQP3 mRNA和蛋白的表達與術前比較差異有統計學意義(P＜0.05),而與假手術組比較差異無統計學意義(P＞0.05);術后6、9個月與術前比較差異有統計學意義(P＜0.01),與假手術組比較差異也有統計學意義(P＜0.05)。假手術組術后6、9個月AQP3 mRNA和蛋白的表達與術前比較差異也有統計學意義(P ＜0.05),見圖 2、3,表 1、2。

圖2 AQP3 mRNA在大鼠軟骨終板中的表達

圖3 AQP3蛋白在大鼠軟骨終板中的表達

3 討 論

椎間盤是一個富含水分的器官,其中髓核的含水量在幼年時高達80%以上,老年時則為70%。而退變椎間盤的一個特征性表現為含水量的下降,臨床工作中經?？梢钥吹窖吹幕颊咂渥甸g盤MRI信號的異常,主要為T2加權相椎間盤低信號,說明水的代謝對椎間盤的功能非常重要[4]。1991年,Agre等[5]發現了AQP1,它是細胞中特異的轉運水分子的通道,并獲得了2003年諾貝爾化學獎,AQPs在機體水平衡和內穩態的維持中發揮重要作用。目前研究已發現了11種AQP,其中AQP 0～6只能通過水,而 AQP 3、7、9除了對水有高通透性,對甘油也有通透性。有研究發現在椎間盤終板軟骨上有AQP3的表達[3,6]。AQP3為水與甘油的雙重通道,其在很多組織器官都有表達,如腎集合管、皮膚、眼、前列腺、子宮、曲精管、骨骼肌等[7-8]。甘油是合成碳水化合物的重要原料之一,而椎間盤富含蛋白多糖、膠原等基質,另外其還參與糖異生,與能量代謝相關;由其和兩分子脂酸一分子磷酸及含氮化合物結合形成的甘油磷脂還是構成脂質雙分子層的基本骨架。有研究表明AQP3轉運甘油給磷脂酶D2,然后合成磷脂酰甘油,后者為一有活性的脂質成分,進而又可以調節細胞功能[9]。

理想的椎間盤退變動物模型應與人類椎間盤退變的生理進程具有相似性和可比性,文獻報道主要有兩類方法:(1)自然椎間盤退變模型;(2)誘發性椎間盤退變模型。后者主要采用的方法有纖維環損傷法、髓核損傷法等[10-11]。本研究采用椎間盤間接損傷法,主要原因在于人類椎間盤退變時并無直接損傷。而且以前的研究也顯示腰椎失穩的方法可以成功的建立椎間盤退變的模型,從X線片上可以看出椎間隙的狹窄,軟骨終板有鈣化[12]。有研究表明軟骨終板的功能類似于關節軟骨,其對椎間盤的正常生理功能具有重要作用[13]。關節軟骨的代謝活性受物理化學因素如離子和滲透環境的影響,從而會改變細胞的體積和形狀。軟骨內離子和滲透壓的濃度已被證實可改變細胞的形態,影響細胞的黏彈機械特性[14]。營養物質通過軟骨終板的滲透進入椎間盤內,而髓核細胞的代謝產物亦是通過滲透移出椎間盤。當AQP3表達異常時,軟骨終板的滲透作用出現異常,當軟骨終板的滲透作用下降后,就可能導致椎間盤細胞的活性下降,引起或加重椎間盤的退變。本研究結果顯示在椎間盤退變過程中,AQP3的表達進行性下降,結合AQP3具有轉運水和甘油的重要功能,提示AQP3的表達異?？赡苁亲甸g盤退變的重要原因之一。

椎間盤退變時軟骨終板AQP3的表達下調的原因,一是椎間盤應力發生改變,機械應力可能對AQP3的表達有調節作用;二是椎間盤退變局部炎性因子的調控作用,有研究表明TNF-a可下調AQP的表達,椎間盤退變時,TNF-a的含量增高[15]。Zelenina等[16]發現細胞外基質 pH下降可以導致AQP3的表達可逆性下降,在椎間盤出現退變時由于糖酵解的作用,乳酸排泄障礙,局部微環境pH下降。由于椎間盤退變機制十分復雜,對于AQP3和椎間盤功能改變之間的關系需要進一步的研究,借助于基因轉染、基因沉默等先進技術對AQP3進行深入的研究,可能會更好地揭示其作用。

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The expression of aquaporin 3 in the progress of intervertebral discs degeneration

CaoGuoyong1,Yang Yuyong1,J iang Yong1,Long Yi1,Li Jie1,Zhou Yue2△
(1.Department of Orthopaedic,Chongqing Municipal Corps Hospital,Chinese People′s Armed Police Forces,Chongqing 400061,China;2.Department of Orthopaedic,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400061,China)

ObjectiveTo elucidate the expression characteristics of aquaporin 3(AQP3)in the intervertebral discs degeneration,and the correlation between the expression and intervertebral disc degeneration.MethodsThe animal model of lumbar intervertebral discs degeneration was constructed by destroying the balance of lumbar stabilization.The expression of AQP3 was detected by RT-PCR and Western blot.ResultsBy lumbar disequilibrium,the rattus model of lumbar intervertebral discs degeneration was set up.Following the process of degeneration of lumbar intervertebral discs,the expression of AQP3 was descendent gradually at the mRNA and protein level.In experimental group,it decreased significantly at postoperative three months(P＜0.05),especially at postoperative six and nine months(P＜0.01).ConclusionAQP3 is involved in the development of intervertebral discs degeneration,the down regulation of the expression of AQP3 may be one of the reasons of causing the degeneration of intervertebral discs.

intervertebral disk;cartilage;aquaporin 3

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.04.021

A

1671-8348(2011)04-0359-03

△通訊作者,Tel:13908390792;E-mail:Happyzhou@163.com。

2010-05-09

2010-09-23)

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