Bcl-2和Bax在去卵巢大鼠瞼板腺腺泡上皮表達的研究*

許忠新,李聯祥△,關 華,陳劍華

(河北工程大學醫學院:1.人體解剖學與組織胚胎學教研室;2.醫學檢驗實驗室,邯鄲 056002)

Bcl-2和Bax在去卵巢大鼠瞼板腺腺泡上皮表達的研究*

許忠新1,李聯祥1△,關 華1,陳劍華2

(河北工程大學醫學院:1.人體解剖學與組織胚胎學教研室;2.醫學檢驗實驗室,邯鄲 056002)

目的探討雌激素水平降低致瞼板腺功能障礙的發病機制。方法選用30只雌性青春期SD大鼠,隨機分為對照組和去勢組,每組大鼠15只。分別于術前和術后24周應用放射免疫方法檢測血清雌二醇水平;采用免疫組織化學方法檢測瞼板腺腺泡上皮中Bcl-2和Bax的表達。結果(1)去勢組術后24周血清雌二醇濃度明顯低于對照組(P＜0.01);(2)去勢組瞼板腺腺泡上皮Bcl-2陽性細胞表達率明顯低于對照組(P＜0.01),而Bax陽性細胞表達率明顯高于對照組(P＜0.01)。結論Bcl-2和Bax表達異?？赡苁谴萍に厮浇档椭虏€板腺功能障礙的因素之一。

雌激素類;瞼板腺;原癌基因蛋白質c-bcl-2;bcl-2相關X蛋白質

瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction,MGD)是導致眼表淚膜異常和眼干燥癥的重要原因[1-3]。為探討性激素與眼干燥癥之間的關系,Smith等[4]調查結果表明卵巢早衰患者更傾向于出現眼表損害和眼干燥癥。有研究表明,通過切除大鼠卵巢可引起瞼板腺功能障礙的發生[5]。性激素水平失調致瞼板腺功能障礙的發病機制的專題研究較少,經國內外文獻檢索,唯見林靜等[6]有過描述,但尚欠詳盡。為完善這方面的資料,本研究采用免疫組織化學方法對30只雌性大鼠瞼板腺腺泡上皮細胞Bcl-2和Bax表達進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 動物分組 56～60 d齡SD青春期大鼠30只由河北省實驗動物中心提供,體質量200～240 g。分為對照組(15只)

和去勢組(15只),常規飼養。

1.2 去勢動物模型制作 大鼠術前禁水,予乙醚麻醉后固定四肢,在脊柱兩側第12肋尾側剪毛,用2%碘酊皮膚消毒,75%乙醇脫碘。沿脊柱后正中線外側1～1.5 cm處做縱形切口,依次切開皮膚、分離肌肉、打開壁腹膜,進入腹膜腔,找到卵巢并切除。對照組的手術過程與去勢組相同,但不切除卵巢,只切除卵巢2周圍小部分脂肪組織。

1.3 血清雌二醇檢測 心臟取血2～3 mL,1 500 r/min離心15 min,-20℃保存。用放射免疫分析方法測定血清雌二醇水平(試劑購于天津九鼎生物工程有限公司)。

1.4 組織標本制備 大鼠處死后,立即摘除左側上眼瞼瞼板,縱行分為兩部分,置于5%甲醛液中固定,一部分用于HE染色;另一部用于免疫組織化學染色。組織標本常規石蠟包埋,制作成厚5～7 μ m的連續石蠟切片。

1.5 Bcl-2和Bax蛋白免疫組織化學染色 石蠟切片常規脫蠟水化后,采用SP法進行免疫組織化學檢測。用已知Bcl-2和Bax陽性的正常大鼠睪丸組織標本作陽性對照;用PBS代替一抗作陰性對照。所用兔多克隆抗鼠Bcl-2抗體、兔多克隆抗鼠Bax抗體為美國Santa Cruz公司產品,免疫組織化學染色SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.6 Bcl-2和Bax陽性細胞的判斷標準及計數 瞼板腺腺泡上皮細胞的細胞膜、細胞質有棕黃色顆粒分布即為Bcl-2和Bax陽性表達細胞。每例標本選5張切片,隨機選取10個高倍視野(×400倍)的瞼板腺組織,然后計算出各組大鼠瞼板腺腺泡上皮細胞Bcl-2或Bax陽性細胞率(瞼板腺腺泡上皮Bcl-2或Bax陽性細胞率=瞼板腺腺泡上皮細胞中Bcl-2或Bax陽性細胞個數/瞼板腺腺泡上皮細胞總數×100%)。為減少誤差,固定2人在多目顯微鏡下同時觀察同一切片,以核對后結果為準。1.7 統計學處理 用SPSS11.5統計軟件進行統計學處理,測定結果以±s表示,兩組間均數比較采用t檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清雌二醇水平 去勢組術后24周血清雌二醇水平顯著低于對照組(P＜0.01),見表1。

表1 血清雌二醇水平( ±s,pg/mL)

表1 血清雌二醇水平( ±s,pg/mL)

*:P＜0.01,與對照組比較。

組別 手術前 手術后(24周)對照組 30.33±3.60 28.15±2.02去勢組 29.98±2.87 8.99±3.03*

2.2 Bcl-2和Bax陽性細胞表達 Bcl-2和Bax陽性細胞的細胞質或細胞膜呈淡黃色、黃色或深黃色,細胞核不著色,見封2圖1。去勢組瞼板腺腺泡上皮細胞Bcl-2陽性細胞表達率明顯低于對照組(P＜0.01);而去勢組Bax陽性細胞表達率明顯高于對照組(P＜0.01),見表2。

表2 Bcl-2和 Bax陽性細胞表達率( ±s,%)

表2 Bcl-2和 Bax陽性細胞表達率( ±s,%)

*:P＜0.01,與對照組比較。

組別 Bcl-2陽性細胞率 Bax陽性細胞率對照組 42.85±4.11 20.34±5.05去勢組 15.52±3.23* 58.46±3.07*

3 討 論

很早以前人們發現,絕經后婦女眼干燥癥的發病率明顯升高,推測眼干燥癥的發生可能與雌激素水平的降低有關[7]。為了探討性激素與瞼板腺的關系,李聯祥等[8-9]先后研究了人、大鼠等瞼板腺腺泡上皮性激素受體的表達情況,認為雌激素及其受體的活動與瞼板腺的分泌功能有關,當雌激素減少后,受體活動減弱,進而誘發眼干燥癥的發生,之后通過動物實驗驗證了這一推測[10-11]。

目前,細胞凋亡調控失衡是研究各種類型眼干燥癥發病機制的熱點之一,無論哪種類型的眼干燥癥,國內外學者多注重研究淚腺、結膜組織細胞的凋亡變化,真正涉及瞼板腺組織細胞凋亡的研究報道極少。凋亡是一種主動的、有調控的細胞死亡形式,許多基因參與了細胞凋亡的調控。Bcl家族是研究細胞凋亡常用的一類調控基因[12];Bcl-2和Bax是其家族中重要的2種基因蛋白。Bcl-2蛋白位于細胞核膜、內質網和線粒體外膜上[13],是細胞凋亡抑制基因的典型代表,其通過抑制細胞色素C的釋放,最終發揮抑制凋亡的作用。Bax蛋白具有促進細胞凋亡的作用,其主要位于細胞質內,但當凋亡發生時,它從細胞質內轉移到線粒體,并與線粒體膜相結合,然后轉移到線粒體內,可引起線粒體釋放大量的蛋白質,包括細胞色素C等蛋白分子的釋放,誘導半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活,引起細胞的凋亡[14]。瞼板腺分泌的脂質具有潤滑角膜及結膜、減少淚膜水分的蒸發、參與屈光作用、防止眼干燥癥發生作用。本研究結果顯示對照組瞼板腺腺泡上皮Bcl-2陽性細胞表達率明顯大于Bax陽性細胞表達率,這樣有利于抑制細胞凋亡,在維持正常瞼板腺腺泡上皮細胞的分化、增殖速率,確保瞼板腺正常組織形態的構建和分泌功能、維持正常眼表結構的健康方面具有重要意義。相反,在去勢組瞼板腺腺泡上皮Bax陽性細胞表達率明顯大于Bcl-2陽性細胞表達率,表明卵巢切除后,在雌激素水平降低的狀態下,瞼板腺腺泡上皮細胞凋亡加速,干擾和破壞了瞼板腺組織細胞正常分化速率,最終導致具有分泌功能的腺上皮細胞數量相對減少,分泌脂質相對缺乏。因此,瞼板腺腺泡上皮Bcl-2和Bax異常表達是雌激素水平降低致瞼板腺功能障礙的機制之一。至于雌激素水平降低通過哪種信號傳導途徑誘發Bcl-2和Bax異常表達值得進一步研究。

Bcl-2和Bax自身或彼此之間具有形成二聚體的能力,二者之間的比例決定著細胞的生存還是凋亡[15]。有實驗表明Bcl-2/Bcl-2和Bax/Bcl-2二聚體具有抑制凋亡的作用,而Bax/Bax二聚體具有促進凋亡的作用。本研究結果顯示去勢后在雌激素水平降低狀態下,瞼板腺腺泡上皮細胞的Bax/Bax二聚體更容易形成,使細胞處于促進凋亡狀態。

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Expression of Bcl-2 and Bax in the meibomian gland acinar epithelial cell at ovariectomized rats*

XuZhongxin1,Li Lianxiang1△,Guan Hua1,Chen J ianhua2
(1.Departmentof Anatomy and Tissue Embryology;2.Laboratory of Medicine,Medical College of Hebei Engineering University,Handan 056002,China)

ObjectiveTo explore the mechanism of meibomian gland dysfunction caused by low estradiol at ovariectomied rats.Methods30 SD female adolescent rats were divided into control group and the ovariectomized group randomly(15 rats in each group).Serum estradiol levels of two groups rats were measured by radioimmunoassay at pre-operation and 24 weeks after operation.The meibomian gland were observed using immunohistochemistry methods.Results(1)The estradiol level of the castrated group was significantly decreased compared with that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01).Bcl-2 positive cells of the castrated group was significantly lower than that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01);Bax positive cells of the castrated group was significantly higher than that of the control group at 24 weeks after operation(P＜0.01).ConclusionAbnormal expression of Bcl-2 and Bax may be one of the mechanisms of the meibomian gland dysfunction with low level estradiol at ovariectomied rats.

estrogens;meibomian glands;proto-oncogene proteins c-bcl-2;bcl-2-associated X protein

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.05.002

A

1671-8348(2011)05-0420-02

河北省邯鄲市科技局資助項目(072917061-4)?！? class="emphasis_bold">通訊作者,

,Tel:(0310)3115836;E-mail:jpx kn@126.com。

2010-03-08

2010-08-22)

·論 著·