益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang從基礎研究到產業化開發

張和平

（內蒙古農業大學 乳制品加工研究室,呼和浩特 010018）

益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang從基礎研究到產業化開發

張和平

（內蒙古農業大學 乳制品加工研究室,呼和浩特 010018）

2001年-2009年，內蒙古農業大學“乳品生物技術與工程”教育部重點實驗室從采集自中國西部7個省市及蒙古國14個省市不同少數民族地區951份自然發酵乳制品等樣品中分離鑒定出3 388株乳酸菌，建立了中國首個原創性乳酸菌菌種資源庫；從菌種庫中分離自傳統發酵酸馬奶（koumiss）的243株乳桿菌中篩選獲得1株性能優良的乳酸菌—Lactobacillus casei Zhang（L.casei Zhang）。采用5種動物模型和人體試驗進行了功能評價，并利用基因組學和蛋白質組學研究技術對L.casei Zhang益生分子機制進行了深入剖析。經過多年系統的基礎研究，自主解決了其產業化的關鍵技術問題，包括其直投式發酵劑、發酵乳制品和發酵豆乳益生菌飲料的研發并實現了產業化。

益生菌Lactobacillus casei Zhang；基礎研究；產業化

0 引 言

近10年來，我國乳品工業進入了高速發展階段，特別是益生菌發酵乳制品的產銷售量逐年增加，年平均增長率達到20%以上。遺憾的是，目前乳品企業幾乎全部采用進口益生乳酸菌菌種和發酵劑，不僅生產成本高，更重要的是長此以往必將制約乳酸菌和發酵乳制品產業的發展。解決這一問題的根本在于研究和開發具有自主知識產權的益生乳酸菌菌種和發酵劑的相關技術和產品。

在益生菌研究領域，日本及歐美發達國家通過廣泛深入地研究和多年的積累，都已開發出國際知名菌株及其產品，并進行了相應的專利保護。隨著“人類基因組計劃”的順利完成，該研究領域也逐漸深入到“組學”水平。我國在益生菌研究方面起步相對較晚，基礎研究不系統、不深入、無連續性、研究分散、也不集中。高校及其它研究機構都還沒有建立真正意義上的乳酸菌菌種資源庫，同時對益生菌的基礎研究也不系統，在基因組學和蛋白組學研究領域更是滯后于國際?；A研究的不足使得產業化嚴重滯后。

益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang是我國自主研發的、具有自主知識產權益生乳酸菌，經過10多年的基礎研究積累,成功的進入了工業化生產。本文就益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang從基礎研究到產業化開發加以介紹。

1 乳酸菌資源的收集和菌種資源庫的建立［1-26］

2001年-2009年，分別從中國內蒙古、新疆、西藏、青海、云南、四川、甘肅等少數民族居住地區以及蒙古國14個省市采集自然發酵酸馬奶、酸駝奶、酸牦牛奶、酸牛奶、酸山羊奶、乳扇、乳餅、酸乳清、鮮牛奶、曲拉、發酵奶油等傳統發酵乳制品等計951份。依據乳酸菌鑒定技術規程，采用生理生化并結合分子生物學手段，從上述采集的樣品中分離、鑒定、保藏了7個屬，58個種和亞種的共3,388株乳酸菌，建成了中國最大的具有自主知識產權的乳酸菌菌種資源庫。同時完成了3,388株乳酸菌16S rRNA基因序列的測定和分析工作，數據已上傳到NCBI上（http：//www.nibi.nlm.nih.gov/，菌株編號：IMAU10001-IMAU80872）。

2 益生菌L.casei Zhang的篩選及功能評價［27-43,70-71］

2.1 益生菌L.casei Zhang的篩選

綜合耐酸性、耐膽鹽性能、?；悄懰徕c水解能力、模擬胃腸消化體系的轉運等指標，從菌種資源庫分離自傳統酸馬奶的243株乳桿菌中篩選獲得1株優良潛質的益生菌L.casei Zhang。L.casei Zhang在pH為3.0和2.5的人工胃液中消化3 h及在pH 8.0的人工模擬腸液中消化8 h后的存活率分別為為98.4%，69.4%，97.6%和95.37%，可耐受膽鹽的最大濃度為1.6 g/100 mL；其對Caco-2細胞的黏附率為4.31%；對?；悄懰徕c解共軛所產生的游離膽酸量2.28 mmol/L。

2.2 益生菌L.casei Zhang對高脂血癥模型大鼠脂質代謝的影響

將L.casei Zhang菌體灌胃高脂血癥模型大鼠（2×108cfu/d），30 d后大鼠血液中的甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量分別下降了31.3%和30.8%；肝臟組織中的總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量下降了20.4%和17.5%。說明L.casei Zhang具有降血脂作用。

為了深入研究L.casei Zhang降血脂作用的分子機制，利用DNA芯片技術對大鼠肝臟組織的基因表達進行了檢測。研究表明：灌服L.casei Zhang大鼠肝臟組織中與脂肪酸-氧化相關的5個基因（包括長鏈脂肪酸連接酶、羥酰輔酶A脫氫酶、乙酰輔酶A乙?；D移酶、?；o酶A脫氫酶和戊二酰-輔酶A脫氫酶）的表達量顯著升高（P＜0.05），這表明L.casei Zhang可以加速脂肪酸的氧化進而促進TG的分解代謝從而達到降血脂的作用。

2.3 益生菌L.casei Zhang的免疫調節作用

用L.casei Zhang菌體灌胃小鼠 （2.5×108cfu/d和1×109cfu/d）， 結果表明：L.casei Zhang可明顯上調血液中IFN-γ和IL-12（P＜0.05），下調IL-1α和TNF-α水平 （P＜0.01），同時可顯著提高小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+的比例（P＜0.01），并可顯著增加小鼠血清IgG的含量和小鼠腸黏膜SIgA的含量（P＜0.01）；小鼠腸道粘膜相關淋巴組織中Peyer’s結計數、計分值顯著提高（P＜0.01）， 并可顯著提高腸黏膜內CD3+、IgA+細胞數量及表達強度（P＜0.01）。這說明該菌株對小鼠的細胞免疫、體液免疫及腸黏膜局部免疫具有調節功能。

2.4 益生菌L.casei Zhang對病原性大腸桿菌的拮抗作用

用L.casei Zhang菌體飼喂小鼠（4×107cfu/d），然后分別用E.coli O157和K88進行攻毒,攻毒4 d后取對照組和實驗組未死亡小鼠的腸內容物，用選擇性培養基分離純化大腸桿菌和乳酸菌，并進行基因組ERIC-PCR擴增分析。研究表明，灌服L.casei Zhang可以使攻毒后小鼠的死亡率由66.67%降低至5.56%，在停止飼喂L.casei Zhang的第4 d從小鼠腸道內仍然能分離到L.casei Zhang，但未分離到E.coli O157和K88，同時飼喂L.casei Zhang可使小鼠腸道中大腸桿菌總數明顯低于對照組 （P＜0.01）,這一研究結果表明L.casei Zhang可以在小鼠腸道內定殖并能起到拮抗病原菌的作用。

2.5 益生菌L.casei Zhang對大鼠抗氧化能力的影響

用L.casei Zhang菌體灌服大鼠28 d（4.0×109cfu/d），與對照組相比,L.casei Zhang可使大鼠肝臟組織勻漿中的過氧化物酶 （SOD）和谷胱苷肽過氧化物酶（GSH-Px）活力極顯著提高（P＜0.01），大鼠肝臟組織中的氧化產物-丙二醛（MDA）濃度極顯著降低（P＜0.01）。說明L.casei Zhang可提高大鼠體內抗氧化作用。

2.6 益生菌L.casei Zhang對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用

以H22荷肝癌瘤小鼠為模型，用L.casei Zhang灌服小鼠12 d（5×108cfu/d和1×109cfu/d）。結果顯示：L.casei Zhang實驗組的巨噬細胞吞噬百分率、吞噬指數、小鼠血清中TNF-β含量與對照組比較均有顯著提高（P＜0.01，P＜0.05）；L.casei Zhang菌體對H22移植性腫瘤的生長具有顯著的抑制作用，抑瘤率分別達到40.22%（P＜0.01）和41.90%（P＜0.01）；實驗組H22腫瘤細胞Bcl-2蛋白表達明顯降低，而Bax蛋白表達增強，與荷瘤對照組相比有顯著性差異（P＜0.01）。L.casei Zhang其抗腫瘤機制可能是通過增強荷瘤小鼠免疫功能及同時促進腫瘤細胞Bax蛋白表達，抑制Bcl-2表達，誘導腫瘤細胞凋亡從而發揮抗腫瘤的作用。

2.7 益生菌L.casei Zhang在人體腸道中的存活及對腸道菌群的影響

應用熒光定量PCR（RT-PCR）技術定量研究不同時期24個志愿者糞便中L.casei Zhang的數量,結果顯示：服用L.casei Zhang 28 d時，L.casei Zhang在志愿者糞便中平均為108.55 cfu/g。停止口服L.casei Zhang 14 d時為105.52 cfu/g,這說明L.casei Zhang不僅可以在人腸道中存活,而且可以在人腸道中定植并繁殖；應用種屬特異性引物對服用L.casei Zhang的志愿者腸道內的優勢菌群進行定量分析，結果表明口服該菌株可以有效增加腸道中雙歧桿菌（P＜0.01）和奇異菌群數量（P＜0.0001），梭菌屬的數量顯著減少（P＜0.0001），而擬桿菌數量變化并不顯著;焦磷酸測序（79%reads長度為270 bp；平均每個樣品測序20149條）結果表明L.casei Zhang對受試者腸道微生物豐度產生了顯著的影響，其中服用L.casei Zhang后宿主腸道中擬桿菌門數量顯著上升（P＜0.01），而酸桿菌門、綠彎菌門、脫鐵桿菌門、梭桿菌門、變形菌門等數量顯著下降（P＜0.01），放線菌門呈先上升后下降的趨勢。

3 益生菌L.casei Zhang基因組學和蛋白質組學［44-53,72，73］

3.1 益生菌L.casei Zhang基因組學研究

采用全基因組鳥槍法測定益生菌L.casei Zhang全基因組序列并進行了功能基因組學分析。結果表明：該菌株的基因組由1條染色體（GenBank登錄號：NC_014334）和1個質粒plca36（GenBank登錄號：NC_011352）組成。L.casei Zhang基因組富含雙組分調節系統、糖代謝相關基因，包括大量的磷酸轉移酶系統和一個在乳酸菌中獨有的肌醇代謝基因簇，且編碼一個典型relBE毒素-抗素系毒統，可能對該菌株適應復雜生存環境有重要作用。此外，L.casei Zhang還編碼2個特有胞外多糖合成基因簇和6個粘液結合相關蛋白，具備合成胞外多糖和黏附定植的遺傳學特點。

3.2 益生菌L.casei Zhang蛋白質組學研究

利用蛋白質組研究技術在國際上首次建立了干酪乳桿菌不同生長時期蛋白質表達圖譜，獲得酸和膽鹽脅迫下差異表達蛋白質圖譜。結果顯示：48種蛋白質在L.casei Zhang不同生長階段的表達變化明顯，主要包括代謝及應激相關蛋白，可能有助于L.casei Zhang在穩定期適應環境變化，增強其抗逆能力；在膽鹽脅迫下有26種蛋白表達發生顯著變化，主要包括分子伴侶、糖代謝、轉錄調控、氨基酸代謝和氨基糖代謝相關蛋白；在酸脅迫下有15種蛋白表達發生顯著變化，主要包括分子伴侶、脂類代謝和轉錄調控相關蛋白。兩種不同脅迫環境誘導部分類同蛋白表達發生變化，說明該菌株應對膽鹽和酸脅迫環境可能有共同的調控機制。

4 益生菌L.casei Zhang直投式發酵劑的研發和產業化［54-59］

采用RT-PCR技術系統的研究了L.casei Zhang在不同發酵條件和發酵不同階段16個關鍵酶基因表達模式的變化，包括葡萄糖激酶、β-葡萄糖苷PTS E II、磷酸-絲氨酸結合蛋白磷酸化酶等，建立了L.casei Zhang在高密度發酵過程中的代謝分子機制。根據L.casei Zhang的代謝分子機制和營養需求，對其增菌培養基成分和含量進行篩選和優化，確定了L.casei Zhang的高密度發酵工藝，可獲得活菌數為4×1010cfu/mL以上的發酵液，經冷凍干燥可得到2×1011cfu/g以上活菌數的高活力的發酵劑，可以滿足于益生菌制劑或益生菌發酵乳制品等生產。

在抗冷凍方面的研究中，研究發現冷凍干燥過程中糖類的添加對L.casei Zhang細胞膜的zeta電位、疏水性、流動性和完整性均有不同程度的影響，在此基礎上開發出了適合L.casei Zhang冷凍干燥過程中有效的抗凍保護劑。

2010年6月,合作企業—內蒙古普澤生物制品有限責任公司投資6,000萬人民幣，成功的將L.casei Zhang發酵劑進行了工業化生產，產品中活菌數達到2×1011cfu/g以上，達到國際同類產品的水平。

直投式發酵劑的研發和產業化過程中主要關鍵技術是創造性地將分子生物學技術和理論用于建立益生菌高密度培養的方法和理論開發出了適合用于L.casei Zhang的高密度發酵和抗冷凍干燥技術和工藝。

5 益生菌L.casei Zhang發酵乳制品和發酵豆乳制品的研究開發及產業化［60-69,74，75］

5.1 益生菌L.casei Zhang在牛乳和豆乳中的發酵及貯藏特性的研究

研究結果顯示，接種量相同時，L.casei Zhang在豆乳中的生長速度快于牛乳；發酵結束后，豆乳中活菌數可達109cfu/mL，遠高于牛乳中的活菌數（108cfu/mL）；4℃貯藏28 d期間，L.casei Zhang在豆乳和牛乳中均可維持較高的活菌數（＞108cfu/mL）。說明L.casei Zhang適合用于發酵牛乳和豆乳制品的生產。

為了探明L.casei Zhang生長的分子機理，利用L.casei Zhang全基因組基因芯片對其在牛乳和豆乳發酵過程中的表達譜進行了比較分析。結果顯示：在牛乳中，差顯基因大都參于碳水化合物代謝、能量代謝、無機離子代謝；在豆乳中，除碳水化合物代謝、脂類代謝和無機離子代謝相關基因外，48.6%的上調控基因（＞3倍）與氨基酸轉運和代謝關聯。這說明L.casei Zhang在牛乳、豆乳中有著類似的生長分子機制，但因為不同發酵乳體系在蛋白質、氨基酸和礦物質組成方面不同而使其生長速率有所差異。

5.2 益生菌L.casei Zhang發酵乳和發酵豆乳益生菌飲料的產業化

根據上述分子機理，建立并優化了L.casei Zhang發酵乳和發酵豆乳益生菌飲料的生產工藝。2010年，采用獨特的2段發酵工藝，L.casei Zhang益生菌發酵豆乳飲料—百益多（與我們實驗室開發的另一益生菌Bifidobacterium lactis V9共同發酵）在青島君益食品公司投產，產品中L.casei Zhang活菌達到5×1011cfu/mL以上，是目前我國市場上益生菌飲料中最高活菌數的5倍，且在貨架期內活菌數一直保持不變。

2011年2月，L.casei Zhang成功地應用于內蒙古伊利集團QQ星兒童益生菌乳飲料的生產，一舉打破了多年國外益生菌在我國乳品企業的壟斷局面。

6 結束語

本項目的研究開發不僅打破了多年國外產品和技術的壟斷，而且大大促進和提高了我國益生乳酸菌及其相關技術和產品的自主科技創新能力。該項目的實施和完成，將有助于我國乳酸菌和發酵乳制品產業的可持續發展，同時也可滿足人們日益增長的健康需求。該項目的實施也可為培養我國微生物學、乳品科學、基因組學等領域的高級人才奠定了良好的基礎。

[1]J YU,W H WANG,B L G MENGHE,M T JIRI,et al.Diversity of lactic acid bacteria associated with traditional fermented dairy products in Mongolia[J].Journal of Dairy Science,2011,94（7）：3 229-3 241.

[2]JIACHAO ZHANG,WENJUN LIU,ZHIHONG SUN,et al.Diversity of lactic acid bacteria and yeasts in traditional sourdoughs collected from western region in Inner Mongolia of China[J].Food Control,2011,22（5）：767-774.

[3]JIE YU,ZHIHONG SUN,WENJUN LIU,et al.Rapid identification of Lactic Acid Bacteria Isolated from Home-made Fermented Milk in Tibet[J].Journal of General and Applied Microbiology,2009,55（3）：181-190.

[4]ZHIHONG SUN,WENJUN LIU,JIACHAO ZHANG,et al.Identification and characterization of the dominant lactobacilli isolated from koumiss in China[J].Journal of General and Applied Microbiology,2010,56：257-265.

[5]ZHIHONG SUN,WENJUN LIU,JIACHAO ZHANG,et al.Identification and characterization of the dominant lactic acid bacteria isolated from traditional fermented milk in Mongolia[J].Folia Microbiol,2010,55（3）：270-276.

[6]WEN YI ZHANG,YUE YING YUN,TIAN SONG SUN,et al.Isolation and Identification of Dominant Microorganisms Involved in Naturally Fermented Goat Milk in Haixi Region of Qinghai,China[J].Annals of Microbiology,2008,58（2）：213-217.

[7]WENJUN LIU,ZHIHONG SUN,JIACHAO ZHANG,et al.Analysis of microbial composition in acid whey for dairy fan making in Yunnan by conventional method and 16S rRNA sequencing[J].Current Microbiology,2009,59（2）：199-205.

[8]JUNGUO WANG,XIA CHEN,WENJUN LIU,et al.Identification of Lactobacillus from Koumiss by Conventional and Molecular Methods[J].European Food Research and Technology,2008,227：1555-1561.

[9]AIRIDENGCAICIKE,XIA CHEN,XIAOHUA DU,et al.Isolation and Identification of Cultivable Lactic Acid Bacteria in Traditional Fermented Milk of Tibet in China[J].International Journal of Dairy Technology,2010,63（3）：437-444.

[10]RINA WU,LIPING WANG,JICHENG WANG,et al.Isolation and Preliminary Probiotic Selection of Lactobacilli from Koumiss in Inner Mongolia[J].Journal of Basic Microbiology,2009,49：1-9.

[11]WENJUN LIU,QIUHUA BAO,JIRIMUTU,et al.Isolation and I-dentification of Lactic Acid Bacteria from Tarag in Eastern Inner Mongolia of China by 16S rRNA Sequences and DGGE analysis[J].Microbiological Research,doi：10.1016/j.micres.2011.05.001.

[14]張家超，王芳，徐海燕，等.6種區分乳酸乳球菌亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種的分子生物學方法比較[J].微生物學報,2010,50：1670-1676.

[15]王宏梅,于潔,包秋華,等.利用16S rDNA序列及tuf-RFLP鑒定蒙古國發酵乳中的乳酸菌[J].中國乳品工業,2011,39（7）：4-7.

[16]高娃，于潔，烏蘭，等.蒙古國傳統發酵乳中部分乳桿菌16S rRNARFLP分類研究[J].中國乳品工業，2010，38（1）：4-7.

[17]劇檸，張家超，孫志宏，等.藏北地區傳統發酵乳中乳桿菌的多樣性分析[J].微生物學報，2009，49（11）：1540-1547.

[18]杜曉華，艾日登才次克，李莉，等.蒙古國地區酸乳中乳酸菌的鑒定及耐酸菌株篩選[J].微生物學通報，2009，36（7）：4-7.

[19]艾日登才次克，于潔，杜曉華，等.16S rDNA_RFLP法快速鑒定蒙古國傳統乳制品中的乳酸菌[J].中國農業科技導報，2009，11（2）：63-68.

[20]H P ZHANG.Traditional Dairy Products for Chinese Minorities（Review）.In：Asian Indigenous Dairy Products[J].Bulletin of The International Dairy Federation，2007，415：21-26.

[21]劉紅霞，徐杰，云月英，等.蒙古戈壁地區自然發酵乳中乳酸菌的分離鑒定[J].微生物學雜志，2007，27（3）：42-46.

[23]孫天松，王俊國，張列兵，等.中國新疆地區酸馬奶中乳酸菌生物多樣性研究[J].微生物學通報，2007，34（3）：451-455.

[24]張文羿，徐杰，云月英，等.青海省海西地區傳統發酵山羊乳中乳酸菌的分離鑒定[J].中國乳品工業，2006，34（11）：4-8.

[25]孫天松，劉紅霞，倪慧娟，等.傳統發酵酸駝乳中乳酸菌的分離及鑒定[J].中國乳品工業，2006，34（9）：4-7.

[26]烏日娜，張和平，孟和畢力格.酸馬奶中乳桿菌Lb.casei Zhang和ZL12-1的16S rDNA基因序列及聚類分析[J].中國乳品工業，2005，33（6）：4-9.

[27]YA TUO,QIJIN ZHANG,FULIANG CHU,et al.Immunological evaluation of Lactobacillus casei Zhang：a newly isolated strain from koumiss in Inner Mongolia,China[J].BMC Immunology,2008,9：68.

[28]YONG ZHANG,RUITING DU,LIFENG WANG,et al.The antioxidative effects of probiotic Lactobacillus casei Zhang on the hyperlipidemic rats[J].European Food Research and Technology,2010,231（1）：151-158.

[29]GERILETU,RIHUA XU,HONGLIN JIA,et al.Immunogenicity of Orally Administrated Recombinant Lactobacillus casei Zhang Expressing Cryptosporidium parvum Surface Adhesion Protein P23 in Mice[J].Current Microbiology,2011,62：1573-1580.

[30]ZHUANG GUO,JICHENG WANG,LIYA YAN,et al.In vitro comparation of probiotic properties of Lactobacillus casei Zhang,a potential new probiotic,with selected probiotic strains[J].Lwt-Food Science And Technology,2009,42：1640-1646.

[31]QI ZHOU,JICHENG WANG,ZHUANG GUO,et al.Fermentation characteristics and transit tolerance of probiotic Lactobacillus casei Zhang in mare milk during storage[J].International Journal of Dairy Technology,2009,62（2）：249-254.

[32]XIA CHEN,MEI YANG,ZHIHONG SUN,et al.Molecular Cloning and Characterization of alpha subunit of H+-ATPase in Lactobacillus casei Zhang[J].Czech Journal of Food Sciences,2009,27（1）：49-5433.

[33]王記成，郭壯，閆麗雅，等.益生菌Lactobacillus casei Zhang與商業益生菌對胃腸轉運耐受性及發酵特性的比較[J].中國食品學報，2009,9：14-21.

[34]張和平，孟和畢力格，王俊國，等.分離自內蒙古傳統發酵酸馬奶中L.casei Zhang潛在益生特性的研究[J].中國乳品工業，2006，34（4）：4-10.

[35]張和平，張七斤，孟和畢力格，等.L.casei Zhang對小鼠T淋巴細胞亞群及血清IgG和腸黏膜SIgA的影響[J].中國乳品工業，2006，34（10）：4-8.

[36]孫杰宇，高鵬飛，麻士衛，等.益生菌Lactobacilllus casei zhang對小鼠急性毒性的研究[J].中國農業科技導報,2009,11（5）：77-82.

[37]王俊國，孟和畢力格，張和平，等.干酪乳桿菌Zhang對大鼠抗氧化能力的影響[J].營養學報，2009，31（1）：63-65.

[38]托婭，張和平.一株分離自內蒙古傳統酸馬奶中的乳酸桿菌Lactobacillus casei Zhang對小鼠免疫功能的影響[J].中外醫療,2008,27：39－42.

[39]張和平，張七斤，任貴強，等.乳酸桿菌對攻毒小鼠的保護作用和對腸道菌群的影響[J].微生物學通報，2007，34（3）：447-451.

[40]托婭，蘇雅勒瑪，張和平.乳桿菌L.casei Zhang對小鼠血清中細胞因子水平的影響[J].食品科學，2006，27（11）：488-491.

[41]云月英，王立平，陳永福，等.喂飼Lactobacillus casei Zhang對大鼠體內脂質代謝的影響[J].微生物學通報，2006，33（3）：60-64.

[42]托婭，杜瑞亭，張和平.益生菌L b.casei Zhang對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及機制[J].腫瘤防治研究，2010,37（4）：463-465.

[43]托婭，張和平.乳酸桿菌Lactobacillus casei Zhang的抗腫瘤作用及機制[J].分子診斷與治療雜志，2010,2（6）：394-399.

[44]WENYI ZHANG,DONGLIANG YU,ZHIHONG SUN,et al.Complete genome sequence of Lactobacillus casei Zhang,a new probiotic strain isolated from traditional home-made koumiss in Inner Mongolia of China[J].Journal of Bacteriology,2010,192（19）：5268-5269.

[45]WENYI ZHANG,DONGLIANG YU,ZHIHONG SUN,et al.Complete nucleotide sequence of plasmid plca36 isolated from Lactobacillus casei Zhang[J].Plasmid,2008,60：131-135.

[46]ZHANG W,D YU,Z SUN,et al.The comparative analysis of a prophage remnant Lcazh1 in relation to other Lactobacillus prophages,particularly Lp3.[J].International Journal of Dairy Technology,2010,63（1）：413-417.

[47]W ZHANG,Z SUN,T SUN,et al.PCR Screening and Sequence Analysis of iol Clusters in Lactobacillus casei Strains Isolated from Koumiss[J].Folia Microbiol,2010.55（6）：603–606.

[48]WENYI ZHANG,ZHIHONG SUN,DONGLIANG YU,et al.Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2010,26：1949-1955.

[49]WENYI ZHANG,DONGLIANG YU,ZHIHONG SUN,et al.Preliminary analysis of glutathione S-transferase homology from lactobacillus casei zhang[J].Annals of Microbiology,2009,59（4）：727-731.

[50]RINA WU,WEIWEI WANG,DONGLIANG YU,et al.Proteomic Analysis of Lactobacillus casei Zhang,a New Probiotic Bacterium Isolated from Traditionally Home-made Koumiss in Inner Mongolia of China[J].Molecular and Cellular Proteomics,2009,10：2321-2338.

[51]RINA WU,ZHIHONG SUN,JUNRUI WU,et al.Effect of Bile Salts Stress on Protein Synthesis of Lactobacillus casei Zhang Revealed by Two-Dimensional Gel Electrophoresis[J].Journal of Dairy Science,2010,2010,93（8）：3858-3868.

[52]RINA WU,WENYI ZHANG,TIANSONG SUN,et al.Proteomic analysis of responses of a new probiotic bacterium Lactobacillus casei Zhang to low acid stress[J].International Journal of Food Microbiology,2011,147：181-187.

[53]張文羿，孟和，張和平.乳酸菌基因組學研究進展[J].微生物學報，2008，48（9）：1270-1275.

[54]LI HAIPING,LU MEIJUN,GUO HONGFANG,et al.Protective Effect of Sucrose on the Membrane Properties of Lactobacillus casei Zhang Subjected to Freeze-Drying[J].Journal of Food Protection,2010,93（3）：884-892.

[55]WENJING ZHAO,YAN LI,PENGFEI GAO,et al..Validation of reference genes for real-time quantitative PCR studies in gene expression levels of Lactobacillus casei Zhang[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.2011,DOI 10295-010-0906-3.

[56]李妍，趙文靜，高鵬飛，等.益生菌Lactobacillus casei Zhang高密度發酵培條件的研究[J].微生物學通報，2009，36（2）：181-186.

[57]李妍，高鵬飛，趙文靜，等.益生菌Lactobacillus casei Zhang高密度發酵中試工藝及動力學研究[J].中國農業科技導報，2008,10：65-71.

[58]高鵬飛，李妍，趙文靜，等.益生菌L.casei zhang增殖培養基的優化[J].微生物學通報，2008，35（4）：623-628.

[59]趙文靜，徐潔，包秋華，等.實時熒光定量PCR中內參基因的選擇[J].微生物學通報.2010,37（12）：1825-1829.

[60]JICHENG WANG,ZHUANG GUO,QING ZHANG,et al.Fermentation Characteristics and Transit Tolerance of Probiotic Lactobacillus casei Zhang in Soymilk and Bovine Milk during Storage[J].Journal of Dairy Science,2009,92：2468-2476.

[61]QI ZHOU,JICHENG WANG,ZHUANG GUO,et al.Fermentation characteristics and transit tolerance of probiotic Lactobacillus casei Zhang in mare milk during storage[J].International Journal of Dairy Technology,2009,62（2）：249-254.

[62]JICHENG WANG,ZHUANG GUO,QING ZHANG,et al.Effect of Probiotic Lactobacillus casei Zhang on Fermentation Characteristics of Yogurt[J].International Journal of Dairy Technology,2010,63：105-112.

[63]HAIKUAN WANG,CHENG DONG,YONGFU CHEN,et al.A New Probiotic Cheddar Cheese with high ACE-inhibitory activity and Gamma-aminobutyric acid content by Koumiss-Derived Lactobacillus casei Zhang[J].Food technology and biotechnology,2010,48：62-70.

[64]JICHENG WANG,WENYI ZHANG,ZHI ZHONG,et al.Transcriptome analysis of probiotic Lactobacillus casei Zhang during fermentation in soymilk[J].Journal of industrial Microbiology and biotechnology,2011 doi：10.1007/s10295-011-1015-7.

[65]程濤，郭壯，王記成，等.益生菌Lactobacillus casei Zhang發酵特性的評價[J].中國乳品工業，2009，37（6）：4-7.

[66]郭壯，王計成，閆麗雅，等.益生菌Lactobacillus casei Zhang對酸奶風味、質地及感官特性的影響[J].中國乳品工業，2009，37（1）：14-20.

[67]程濤，王記成，張和平，益生菌Lb.casei Zhang在酸乳酪中的發酵特性[J].中國乳品工業，2008，36（7）：4-8.

[68]閆麗雅，郭壯，王記成，等.益生菌Lb.casei Zhang在酸乳中發酵特性研究[J].乳業科學與技術，2008（4）：151－156.

[69]徐杰，云月英，張文羿，等.酸馬奶中干酪乳桿菌發酵特性的研究[J].中國乳品工業，2006，34（7）：23-27.

[70]張和平，孟和畢力格.一種干酪乳桿菌及其在改善血脂代謝和免疫調節中的應用[P].中國專利,ZL200610126889.3.

[71]張和平，王俊國，孟和畢力格.一種干酪乳桿菌在抗氧化作用方面的應用[P].中國專利,ZL200710109474X.

[72]張和平，陳霞，孟和畢力格，等.一種H+-ATP酶耐酸基因atpA和包括該基因的干酪乳桿菌[P].中國專利,ZL200710129939.8.

[73]張和平，張文羿，陳霞，等.一種結合膽鹽水解酶基因和包括該基因的干酪乳桿菌[P].中國專利,ZL200710143906.9.

[74]張和平，高鵬飛，崔景麗，等.一種干酪乳桿菌及其在固態發酵中的應用[P].中國專利,ZL200710118485.4.

[75]張和平，包秋華，張家超.益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定性、定量檢測方法[P].中國專利,ZL2009101779106.

Probitotic Lactobacillus casei Zhang from basic research to industrialization

ZHANG He-ping
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Education Ministry of China,Dairy Processing Laboratory of National Dairy Industry and Technology System,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China）

During 2001-2009,we have isolated,identified and collected 3,388 strains of lactic acid bacteria from 951 naturally fermented dairy products（including fermented cow milk,mare milk,goat milk,camel milk and yak milk）in Inner Mongolia,Xinjiang,Qinghai,Tibet,Yunnan,Ganshu and Sichuan of China and 17 provinces of Mongolia,and established the first LAB Collection Center（LABCC）with self-owned intellectual property in China.From 243 strains of lactobaclli isolated from naturally fermented mare milk（koumiss）collected in LABCC,a novel probiotic-Lactobacillus casei Zhang was screened out,and conducted extensive researches on it,including acid tolerance and bile resistance to the gastointestinal digestion,adhesion to Coco-2 human epithelial cells line in vitro,immunomodulatory properties,anti-tumor effects for H22 cancer cell line induced liver tumor,hypocholesterolemic effects,antagonistic to pathogenic Escherichia coli in intestine,anti-oxidative effect in vivo using mice or rat as models,and colonization of in human gut and regulation of gut microbiota for 24 volunteers.Using gemomics and proteomics,we elucidated its probiotic mechanism partially.Basic research about probiotic Lactobacillus casei Zhang promoted its application in industry,including industrialization of direct-to-vat starter culture,fermented milk drink and fermented probiotic soymilk drink.

Probiotic Lactobacillus casei Zhang,Basic research,Industrialization

TQ920.1

B

1001-2230（2011）10-0032-05

2011-08-29

農業部現代農業產業技術體系建設項目（nycytx-0501）；國家高技術研究發展計劃（2011AA100901,2011AA100902）；國家杰出青年科學基金（31025019）；973計劃前期研究專項（2010CB134502）；教育部創新團隊發展計劃（IRT0967）；“十一五”國家科技支撐計劃重點項目（2009BADC1B01）。

張和平（1965-），男，教授，研究方向為乳酸菌與發酵乳。