滸苔對不同氮源吸收特性的初步研究

吳 婷,田小亭,劉召輝,石曉勇,史華明

(1.中國海洋大學 化學化工學院,山東 青島 266100;2.國家海洋局 南海工程勘察中心,廣東 廣州510300)

2008年6月,大量滸苔受風力、海流等因素的影響,從黃海中部漂移至青島近海海域,6月中、下旬,滸苔區已靠近膠州灣口奧帆賽區海域附近,且覆蓋密度明顯增大,6月25日滸苔面積達800 km2[1]。其聚集規模之大、持續時間之長,十分罕見,釀成了一場突如其來的自然災害—綠潮。有研究表明,大面積綠潮爆發的主要原因是海水富營養化、氮磷比失衡和適宜的環境氣候條件等[2]。滸苔生長需要豐富的營養鹽條件,對氮的需求很高[3]。鑒于中國此前缺乏對滸苔發生機制、過程等方面的研究和探討,本文通過以 NaNO3、NH4Cl、CO(NH2)2分別作為唯一外加氮源的實驗室培養實驗,研究了 3種不同氮源條件下滸苔對氮的吸收動力學,分析了滸苔對不同氮源的響應,可為深入探討青島近海海域富營養化與滸苔爆發之間的關系提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的滸苔藻種于2008年6月采自青島市大麥島碼頭,從中挑選若干生長狀況良好的藻體,經消毒海水沖洗去除泥污和附生生物后,于中國海洋大學化學化工學院海洋污染生態化學重點實驗室藻種室進行擴大培養。培養介質為f/2培養液。

取生長良好的滸苔接種至未外加氮源的f/2培養液中,饑餓培養48 h,此時培養液中原有氮源已幾乎完全被滸苔吸收消耗。培養條件為：溫度(18±2)℃,光照強度3 000～4 000 lx,光照周期 L ：D 為12 ：12[4]。

1.2 實驗方法

在 NO3-N、NH4-N、CO(NH2)2的吸收動力學實驗中,NaNO3、NH4Cl、CO(NH2)2分別作為唯一的外加氮源。相關研究表明,浮游植物細胞利用有機氮時的氮磷比比利用無機氮時的大很多[5],實驗據此設計培養液氮源梯度(表1),其余組分參照 f/2培養液添加。將經過48 h氮饑餓培養的滸苔從培養瓶中取出,經消毒海水沖洗,分別接種于 1 L玻璃三角燒瓶中,滸苔的初始接種量為 0.5 g/L,接種時間為上午10點。全部實驗均設置兩個平行組,按表1取樣時間分別從三角燒瓶中取 10 mL樣品,過濾(GF/F膜,450℃灼燒4 h),-20℃下冷凍保存,測定樣品中氮源濃度。

表1 培養液氮源濃度及取樣時間Tab.1 Nitrogen concentrations of Enteromorpha prolifera culture and sampling schedule

營養鹽 NO3-N、NH4-N的測試在 BRAN+LUEBBEAA3營養鹽自動分析儀上完成,CO(NH2)2的測定采用二乙酰一肟法[6],該方法相對標準偏差為0.5%。

采用Michaelis-Menten動力學方程的Hofstee轉化式處理實驗數據,可得出吸收動力學參數Vmax(最大吸收速率)和Ks(表觀米氏常數)。該方程可以定量描述穩態時藻類對營養鹽的吸收速率和外部營養鹽濃度的關系。方程的具體形式為：

其中,Ks為吸收速率為最大吸收速率的一半時外界離子濃度,1/Ks表征吸收系統的親合力,Ks值越小,說明滸苔對該離子的親合能力越大。Vmax為吸收所能達到的最大速率,Vmax值越大,表示吸收的潛力越大[7]。

2 結果與討論

2.1 滸苔對氮源的吸收特征

圖1和圖2分別是培養液NO3-N和NH4-N含量變化曲線。結合圖1和圖2可知,無機氮濃度隨著時間增加而逐漸降低,并且吸收率逐漸降低。原因可能是當滸苔處于氮限制時,細胞內的氮庫較小;起初對氮源的快吸收用于充盈細胞內營養庫;隨后吸收率下降至穩定階段則可能是充盈的細胞內氮庫的反饋抑制作用;接著是由介質營養鹽濃度控制的吸收,隨著介質營養鹽的消耗吸收率迅速下降[8]。實驗結果還表明,NO3-N和NH4-N變化趨勢大體一致：NO3-N濃度為10、20、40、80和160μmol/L時分別在第6、12、24和48小時基本降為0;NH4-N濃度為10、20、40和80 μmol/L時分別在第3、24、24和48小時基本降為零,而 160 μmol/L在 48 h時只降低至40μmol/L左右。由此可見,NH4-N濃度下降較NO3-N慢。

圖3是培養液CO(NH2)2含量變化曲線。由圖3可知,CO(NH2)2濃度隨著時間增加呈波動狀態,但整體趨勢降低。在8～24 h之間三種濃度梯度曲線都出現平臺期,且均在24、36 h出現波峰,在30 h出現波谷。濃度為30、120 μmol/L時曲線變化趨勢基本相同,幾乎在相同時刻出現波峰或者波谷,濃度為60 μmol/L時,曲線在36 h后波動范圍很小。濃度為 30、60 μmol/L時,分別在第42、60小時之后CO(NH2)2濃度開始維持在一個很低的水平,濃度為120 μmol/L時,在96 h CO(NH2)2濃度降至15 μmol/L以下。與圖1、2對比可知,相比對無機氮的吸收,0～20 h內,滸苔對CO(NH2)2吸收呈劇烈波動;20 h后CO(NH2)2濃度波動遞減,可能原因是,在20 h前由于細胞不能直接利用有機氮[9],在氮饑餓狀態下起始階段吸收的氮超過生長所需要的量,這是滸苔對外界環境中營養鹽變化的適應;20 h后白天浮游植物的光合作用吸收 CO(NH2)2,而夜晚的呼吸作用利用氧氣,將部分CO(NH2)2還給海水。這與黃海圍隔實驗結論一致[10]。

圖1 培養液NO3-N含量變化曲線Fig.1 Variation of the concentration of NO3-N in culturing Enteromorpha prolifera

圖2 培養液NH4-N含量變化曲線Fig.2 Variation of the concentration of NH4-N in culturing Enteromorpha prolifera

圖3 培養液CO(NH2)2含量變化曲線Fig.3 Variation of the concentration of CO(NH2) in culturing Enteromorpha prolifera

2.2 滸苔對氮源的吸收動力學研究

實驗結果表明：隨著溶液中三種氮源濃度的增加,滸苔對其吸收速率不斷增大。按照 Michaelis-Menten動力學方程擬合,得到滸苔對三種氮源吸收的最大速率(Vmax)和表觀米氏常數(Ks)(表2)?？芍獫G苔對于三種不同氮源的吸收Ks大小順序為 NO3-N＞NH4-N＞CO(NH2)2,最大吸收速率Vmax值順序為NO3-N＞NH4-N＞CO(NH2)2。

對于兩種無機氮源,滸苔對 NH4-N的親和力大于其對NO3-N的親和力(Ks值越大,親和力越小),這一結果在理論上證實了一些學者關于綠藻“優先吸收凈化 NH4-N”的推斷[11]。對于大型海藻優先吸收NH4-N的原因,Flynn[12]的解釋得到較多數人的認可：Flynn從能量學的角度出發,首先考慮到兩種離子各自傳遞和同化過程的不同,假設氮源以帶正電荷的化合物形式與 Na+一起通過帶負電荷的細胞膜電位而被傳遞,同時 K+外流,以維持細胞膜的電位平衡,而 Na+/K+泵則又重新建立起電子梯度。如果該假設成立,則海藻藻體對的吸收利用要比耗費更多的能量,造成能量浪費。實驗結果還表明,滸苔對 NO3-N的吸收潛力大于其對 NH4-N的吸收潛力(Vmax值越大,表示吸收的潛力愈大)。這與浮萍吸收NO3-N和NH4-N的動力學研究實驗結果相符[13],可能與高濃度NH4-N條件下氨對浮萍的毒害作用有關[14]。滸苔對 CO(NH2)2的親和力遠大于兩種無機氮源,吸收潛力遠小于兩種無機氮源?？赡茉蚴荂O(NH2)2中氮為還原態[15],而 NO3-N中的氮呈高氧化態,所以NO3-N在參與代謝時,必須經歷一個還原過程。細胞氮的代謝中,必須以氨的形式與細胞內的碳水化合物衍生的酮酸相作用生成氨基酸,然后生成蛋白質。滸苔以CO(NH2)2為氮源時,CO(NH2)2將在尿素酶的催化下,分解成氨和CO2,進一步被利用[16]。

圖4 滸苔吸收氮源速率與溶液中氮源濃度關系Fig.4 The relationship between the absorption rates of nitrogen by Enteromorpha prolifera and the concentrations of various nitrogen species

表2 各種氮源對滸苔生長影響的Vmax和KsTab.2 Vmax and Ks value of Enteromorpha prolifera in absorbing different nitrogen species

3 結論

滸苔對氮源的吸收動力學研究實驗和分析結果表明,滸苔對無機氮和有機氮的吸收存在明顯的差異,滸苔對有機氮的親和力大于對無機氮的親和力,且對NH4-N的親和力大于其對NO3-N的親和力;滸苔對無極氮的最大吸收速率明顯大于對有機氮的最大吸收速率,且對 NO3-N的最大吸收速率大于對NH4-N的最大吸收速率,說明當介質中氮濃度較高時,滸苔對氮源凈化速率順序為 NO3-N＞NH4-N＞CO(NH2)2。

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