光照及營養鹽對3種赤潮甲藻吞噬營養行為的影響

(暨南大學 赤潮與水環境研究中心,廣東 廣州 510632)

近年來,越來越多過去被認為完全依賴光合自養的甲藻被證實具有吞噬功能而成為混合營養生物[1-2]。吞噬營養可能是甲藻一項重要的生理生態適應策略,有利于甲藻在不斷變化的環境條件下保持營養競爭優勢,尤其是在藻類受到光強或營養鹽限制無法光合自養時,吞噬營養可作為獲取有機碳或主要限制性營養鹽的補充途徑[3-5]?；旌蠣I養策略在甲藻赤潮的形成及發展過程中可能發揮重要作用,開展赤潮甲藻吞噬營養行為的研究有助于深入了解赤潮甲藻的營養競爭策略機制,解釋某些甲藻赤潮在低營養鹽濃度下爆發和長時間維持的機制[4-6]。

東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)和鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)是中國東海主要的赤潮原因種[7]。本論文以人工培養的活體藻類和熒光標記藻類(FLA)為餌料,研究實驗室不同光照及營養鹽條件下3種目標甲藻的吞噬營養行為,并與東海原甲藻赤潮發生現場圍隔實驗中獲得的東海原甲藻的吞噬營養數據進行比較,分析3種赤潮甲藻的營養模式,初步探討吞噬營養模式對 3種赤潮甲藻獲取營養的重要性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及培養條件

米氏凱倫藻、鏈狀亞歷山大藻、東海原甲藻及餌料藻球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、骨條藻(Skeletonemasp.)、旋轉海鏈藻(Thalassiosira curviseriata)、亞心形四爿藻(Platymonas subcordiformis)、赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)來自暨南大學赤潮與水環境研究中心藻種庫。按照低/富營養鹽條件設計將目標甲藻長期用滅菌f/8或f/2培養基培養,餌料藻則都用滅菌 f/2培養基培養,在藻類培養至指數生長期時加入抗生素抑菌。培養條件為：光暗周期 L ：D= 12 ：12,光照 60 μE/(m2·s),溫度 20℃ ± 1 ℃。采用Retiga 4000R圖像分析系統,按照細胞的寬度和深度相等的原則[8],根據 Hillebrand[9]建立的公式計算細胞體積,并將體積轉換成單位細胞碳含量[10]。

按Rublee &Gallegos的方法制備FLA[11]。包括有熒光標記的球等鞭金藻(FLIg)、骨條藻(FLS)及旋轉海鏈藻(FLTc),冷凍保存備用。

1.2 有/無光照及低/富營養鹽條件下3種赤潮甲藻對活體餌料藻的攝食

將3種目標甲藻分別接種至f/2(富營養)及f/8(低營養)培養基中,待目標甲藻生長至指數生長期,取10mL目標甲藻到50 mL的錐形瓶,根據碳生物量相當的原則,分別加入一定數量處于指數生長期的 3種餌料藻進行混合培養,若未發現甲藻吞噬行為,則相對提高添加的餌料藻濃度(表1)。其中一組實驗在正常光照條件下進行,另一組則采用黑暗培養,每組兩個平行,4～6 h后,取一定體積的藻液,在正置熒光顯微鏡(Olympus BX61)的明場模式下觀察甲藻是否有攝食現象,并計算攝食入細胞內的餌料藻的數目,每個樣品觀察細胞數＞200個。采用圖像分析系統拍攝有吞噬營養行為的目標甲藻。實驗中,采用 DAPI(4’ 6’- diamidino- 2- phenylindole)染色樣品,在熒光顯微鏡紫外激發光波段(Ex= 306～370 nm,Em＞420 nm)下觀察,基本排除細菌的影響。

1.3 有/無光照及低/富營養鹽條件下3種赤潮甲藻對FLA的攝食

取10 mL上述f/2和f/8培養基中培養的目標甲藻到 50 mL的錐形瓶(目標甲藻的起始濃度如表1),分別向實驗瓶中添加FLIg、FLS和FLTc(f/2培養條件下餌料藻的終密度分別為2×106,0.8×106和1×106個/ mL,f/8低營養條件下FLA的添加量減半),同樣設置兩組實驗,一組是在正常光照下培養,另一組實驗黑暗培養,每組設兩個平行。4～6 h后,分別取一定體積的藻液,在熒光顯微鏡的明場及藍光波段(Ex= 460～495 nm,Em＞510 nm)下切換觀察目標甲藻是否具有攝食行為,并計算攝食入甲藻細胞里的FLA個數,觀測細胞數＞200個。實驗中,采用DAPI染色樣品,在熒光顯微鏡紫外激發光波段下觀察,基本排除細菌的影響。

表1 實驗藻種的體積、碳含量及起始密度Tab.1 Volume,carbon biomass,and initial concentrations of species tested

1.4 東海赤潮高發區現場船基圍隔實驗中東海原甲藻對熒光標記藻類的攝食

2010年春季,在東海長江口鄰近海域發生了大面積的東海原甲藻赤潮。5月11日,取東海原甲藻赤潮中心區域 Rb16 測站(123°17.95′ E,30°1′ N)的表層海水進行現場船基圍隔實驗,實驗周期為10天。共設 6個圍隔袋(M1～M6),每個圍隔袋水體積大約為700 L,其中M1為對照袋,M2、M3及M6在實驗起始時一次性加入不同濃度的硝酸鹽(NO3- N)、磷酸鹽(PO4- P)和尿素,M4和M5則是每天早上8：30分次加入營養鹽(如表2所示)。實驗期間,利用水泵將現場海水抽入帆布袋內作為循環水,以保持圍隔袋內水溫與現場海水一致。在現場每天測定圍隔袋中的 Chla值,分別在實驗進行的第2、5和 8天(分別代表東海原甲藻藻華的指數生長期、平穩期、衰亡期)進行東海原甲藻對FLA的攝食實驗。

取500 mL水樣,經120 μm篩絹過濾后分裝到3個300 mL的聚乙烯瓶中,置于現場表層海水的水浴中培養 30 min,使瓶中溫度接近于表層海水水溫,分別在瓶中加入 FLIg和 FLTc(終密度約為 2.0×104個/mL),另外一組不加 FLA作對照,黑暗中培養4 h。取20 mL樣品,依次加入魯格試劑(終濃度0.5%)、福爾馬林(終濃度 3 %)及硫代硫酸鈉溶液(終濃度0.1 %)進行固定[12]。放在4 ℃冰箱保存4 h使細胞變硬。

表2 圍隔實驗中添加的營養鹽量Tab.2 Concentrations of nutrients added in mesocosms

在低負壓條件下將樣品過濾至8 μm孔徑的黑膜上。在樣品快過濾完時,加入1 mL的DAPI,終濃度為25 mg/L,搖勻,黑暗培養10 min,將藻液濾干。濾膜在-20 ℃冷凍保存,帶回實驗室鏡檢。觀察時先在熒光顯微鏡的紫外波段下確定為東海原甲藻,在藍光激發波段下觀測原甲藻是否存在吞噬FLA的現象。

2 結果與分析

2.1 有/無光照及低/富營養鹽條件下3種赤潮甲藻對活體餌料藻的攝食

無論是在富營養的 f/2培養基還是低營養的 f/8培養基,也無論是正常光照條件還是黑暗條件,在添加入活體餌料藻的4～6 h后,在顯微鏡下觀測到3種目標甲藻的生理活性良好,在顯微鏡視野下快速游動。

在不同培養條件的實驗組中,分別跟蹤觀測混合培養的 3種目標甲藻的攝食行為。但僅在富營養的f/2及正常光照條件下,觀測到1個游動中的米氏凱倫藻細胞內部攝食有 2個球等鞭金藻,在黑暗及低營養條件下未發現目標甲藻有吞噬營養行為,表明米氏凱倫藻具有吞噬營養行為,但發生攝食的概率極低,是一偶然現象。增大餌料藻的密度,未觀測到3種目標甲藻的吞噬營養行為。

2.2 有/無光照及低/富營養鹽條件下3種赤潮甲藻對FLA的攝食

無論是何種培養條件,添加入 FLIg、FLS和FLTc的4～6 h后,在顯微鏡下觀測到東海原甲藻、鏈狀亞歷山大藻和米氏凱倫藻在視野下快速游動,表明生理狀態良好。

研究結果發現,富營養的 f/2培養基條件下,鏈狀亞歷山大藻在正常光照及黑暗下均有攝食FLTc的現象,觀察＞200個細胞,僅各觀測到1個游動的鏈狀亞歷山大藻細胞攝食2～3個FLTc,表明攝食概率低。實驗中未觀測到鏈狀亞歷山大藻對FLIg和FLS的攝食,也未觀測到東海原甲藻或米氏凱倫藻對FLA的任何攝食。

低營養的 f/8培養基中,無論是正常光照還是黑暗條件下,均未觀測到3種目標甲藻對FLA的攝食。

圖1 游動中的米氏凱倫藻攝食活體球等鞭金藻Fig.1 A swarming Karenia mikimotoi ingested two live Isochrysis galbana

圖2 熒光顯微鏡下鏈狀亞歷山大藻對熒光標記海鏈藻的攝食Fig.2 The ingestion of fluorescent labeled Thalassiosira curviseriata by Alexandrium catenella under epifluorescence microscopy

2.3 東海赤潮高發區現場船基圍隔實驗中東海原甲藻對FLA的攝食

實驗早期,6個圍隔袋中均發現東海原甲藻對FLIg的攝食;而僅在未添加營養鹽的 M1和每天僅添加微量營養鹽的 M4中,發現東海原甲藻對 FLS具有攝食(表3)。東海原甲藻攝食FLIg的數量為1～4個,而一般只攝食1個FLS(圖3),這可能與多數骨條藻為長鏈結構,較難吞噬有關。在觀測的500個細胞中,僅 2～7個東海原甲藻細胞具有攝食行為,攝食概率0.4%～1.4 %。

而在實驗的中后期,即東海原甲藻藻華的發展及衰亡階段,各圍隔袋中均未觀測到東海原甲藻的攝食行為。

表3 圍隔實驗中東海原甲藻對熒光標記藻類的攝食Tab.3 Feeding occurrences of Prorocentrum donghaiense on fluorescent labeled Isochrysis galbana (FLIg) and Skeletonema sp.(FLS)

圖3 熒光顯微鏡下東海原甲藻對熒光標記金藻(a)和骨條藻(b)的攝食Fig.3 The ingestion of fluorescent labeled Isochrysis gallbana (a) and Skeletonema sp.(b) by Prorocentrum donghaiense under epifluorescence microscopy

3 討論

在室內實驗中,首次發現米氏凱倫藻對球等鞭金藻,鏈狀亞歷山大藻對旋轉海鏈藻具有攝食行為;且通過現場船基圍隔實驗,發現東海原甲藻在赤潮發生時,對熒光標記的球等鞭金藻和骨條藻具有攝食行為,這一結果豐富了赤潮甲藻的吞噬營養行為的研究。此前,尚未見米氏凱倫藻吞噬營養行為方面的任何報道。有研究認為鏈狀亞歷山大藻具有食物泡結構且能攝食細菌、藍細菌等原核生物,為混合營養生物[13-14],但報道鏈狀亞歷山大藻攝食真核生物尚屬首次。東海原甲藻和中肋骨條藻是東海海區的兩個重要的赤潮藻種[15-16],Yoo等[17]在實驗室內發現,東海原甲藻能攝食中肋骨條藻(Skeletonema costatum)。本文首次在東海原甲藻赤潮發生現場,觀測到東海原甲藻對球等鞭金藻和骨條藻的攝食。

Jeong的研究團隊認為,多數自養甲藻都可能具有吞噬營養的行為和能力,且這種吞噬行為非常普遍[17-18]。其研究結果表明,處于指數生長期的東海原甲藻、海洋原甲藻在富營養的f/2條件下對中肋骨條藻的攝食率可分別達到 0.5和 3.1 cells/(dinoflagellate·d)[17]。然而,從本室內研究發現,無論是在黑暗或是在營養鹽脅迫的條件下,3種目標甲藻的攝食概率都非常低。雖然不排除目標甲藻對餌料藻的種類及粒徑的選擇性問題[19-20](本文選取不同門類、易被攝食的較小粒徑及海區常見種類),本研究結果認為目標甲藻雖具有吞噬營養的行為及能力,但主要還是依賴光合自養方式獲取營養鹽。也可能存在一種解釋就是,在室內長期富營養和光照充足的培養條件下,目標甲藻的吞噬營養能力已經減弱甚至喪失,造成實驗中對甲藻吞噬行為及其重要性的低估。

圍隔實驗中東海原甲藻攝食概率數據支持了室內研究的結果。實驗前期,東海原甲藻可以攝食FLIg和 FLS,但是發生攝食的概率僅達到 0.4%～1.4 %,表明即使在營養鹽脅迫的條件下,光合自養仍然是東海原甲藻主要獲取營養鹽的方式。有趣的是,在圍隔實驗的中后期,東海原甲藻在營養鹽脅迫加重的情況下,卻未發生攝食行為,該原因是否與不同生長時期東海原甲藻具有不同的營養競爭模式及策略,或一旦進入人工培養狀態甲藻即喪失吞噬營養行為有關,尚有待進一步研究。

4 結論

在富營養的正常光照條件下,觀測到 1個米氏凱倫藻攝食球等鞭金藻;在富營養培養的正常光照及黑暗條件下,各觀測到 1個鏈狀亞歷山大藻攝食旋轉海鏈藻。2010年5月,在東海原甲藻赤潮發生現場的船基圍隔實驗中,前期發現東海原甲藻能攝食球等鞭金藻及骨條藻,但發生攝食的概率也僅為0.4%～1.4%,且隨著培養時間的延長吞噬行為消失。該研究結果表明,雖然東海原甲藻、米氏凱倫藻和鏈狀亞歷山大藻具有吞噬營養行為,為混合營養生物。但無論是在黑暗或是營養饑餓的條件下,3種目標藻發生吞噬營養的概率都非常低,是屬于主要依賴光合自養獲取營養的種類。

致謝：現場圍隔實驗獲得國家海洋局第一海洋研究所孫萍老師的大力幫助,在此表示誠摯感謝。

[1]Glibert P M,Burkholder J M,Kana T M,et al.Grazing byKarenia brevisonSynechococcusenhances its growth rate and may help to sustain blooms [J].Aquatic Microbial Ecology,2009,55：17-30.

[2]Jeong H J,Yoo Y D,Kim J S,et al.Growth,Feeding and ecological roles of the mixotrophic and heterotrophic dinoflagellates in marine planktonic food webs [J].Ocean Science Journal,2010,45(2)：65-91.

[3]Skovgaard A,Hansen P J,Stoecker D K.Physiology of the mixotrophic dinoflagellateFragilidium subglobosum.I.Effects of phagotrophy and irradiance on photosynthesis and carbon content [J].Marine Ecology Progress Series,2000,201：129-136.

[4]Stoecker D,Tillmann U,Granéli E.Phagotrophy in harmful algae [C]// Granéli E,Turner J T.Ecology of Harmful Algae.Berlin：Springer-Verlag,2006：189：177-187.

[5]Burkholder J M,Glibert P M,Skelton H M.Mixotrophy,a major mode of nutrition for harmful algal species in eutrophic waters [J].Harmful Algae,2008,8：77-93.

[6]Smayda T J,Reynolds C S.Strategies of marine dinoflagellate survival and some rules of assembly [J].Journal of Sea Research,2003,49：95-106.

[7]周名江,朱明遠.我國近海有害赤潮發生的生態學、海洋學機制及預測防治研究進展 [J].地球科學進展,2006,21(7)：673-679.

[8]Verity P G,Robertson C Y,Tronzo C R,et al.Relationships between cell volume and the carbon and nitrogen content of marine photosynthetic nanoplankton [J].Limnology and Oceanography,1992,37：1434-1446.

[9]Hillebrand H,Duerslen D,Kirschtel U,et al.Biovolume calculation for pelagic and benthic microalgae[J].Journal of Phycology,1999,35：403-424.

[10]Deuer M S,Lessard E J.Carbon to volume relationships for dinoflagellates,diatoms,and other protist plankton [J].Limnology and Oceanography,2000,45(3)：569-579.

[11]Rublee P A,Gallegos C L.Use of fluorescently labelled algae(FLA) to estimate microzooplankton grazing [J].Marine Ecology Progress Series,1989,51：221-227.

[12]Sherr F B,Sherr E B,PedrosAlio C.Simultaneous measurement of bacterioplankton production and protozoan bacterivory in estuarine water [J].Marine Ecology Progess Series,1989,54：209-219.

[13]Jeong H J,Park J Y,Nho J H,et al.Feeding by red-tide dinoflagellates on the cyanobacteriumSynechococcus[J].Aquatic Microbial Ecology,2005,41：131-143.

[14]Jeong H J,Yoo Y D,Park J Y,et al.Feeding by phototrophic red-tide dinoflagellates：five species newly revealed and six species previously known to be mixotrophic [J].Aquatic Microbial Ecology,2005,40：133-150.

[15]趙冉,孫軍,白潔.2006年秋季長江口及其鄰近水域浮游植物群集 [J].海洋科學,2010,34(4)：32-39.

[16]鄧光,耿亞洪,胡鴻鈞,等.幾種環境因子對高生物量赤潮甲藻—東海原甲藻光合作用的影響 [J].海洋科學,2009,33(12)：34-39.

[17]Yoo Y D,Jeong H J,Kim M S,et al.Feeding by Phototrophic red-tide dinoflagellates on the ubiquitous marine diatomSkeletonema costatum[J].Journal of Eukaryotic Microbiology,2009,56(5)：413-420.

[18]Jeong H J,Park J Y,Nho H J,et al.Feeding by red-tide dinoflagellates on the cyanobacteriumSynechococcus[J].Aquatic Microbial Ecology,2005,41：131-143.

[19]Jeong H J,Yoo Y D,Seong K A,et al.Feeding by the mixotrophic red-tide dinoflagellateGonyaulax polygramma：mechanisms,prey species,effects of prey concentration,and grazing impact [J].Aquatic Microbial Ecology,2005,38：249-257.

[20]Sheng J,Malkiel E,Katz J,et al.A dinoflagellate exploits toxins to immobilize prey prior to ingestion [J].PNAS,2010,107(5)：2082-2087.