鹽藻高效遺傳轉化方法的確立

馮書營 ,劉 岷 ,谷輝輝

(1.河南科技大學醫學技術與工程學院,河南洛陽 471003;2.河南省中醫學院第一附屬醫院,河南鄭州 450000;3.鄭州大學生物工程系,河南鄭州 450001)

0 前言

鹽藻是生活在海洋中的一種單細胞真核綠藻,其自身無毒無害、營養價值高,又屬于真核生物、無細胞壁,便于進行遺傳轉化以生產外源性蛋白[1-2],目前已被開發作為一種新型的生物反應器[3]。該新型生物反應器在生產外源性功能蛋白時,遺傳轉化環節成為其主要限制性因素之一。關于鹽藻的轉化研究有文獻報道,其轉化方法有基因槍法[4]和電擊法[5],但二者方法都存在操作繁瑣、轉化率低等缺點,限制了二者的應用。鑒于該研究現狀,本文作者借鑒于其他藻類的轉化方法[6],在鹽藻中建立起新型的玻璃珠轉化法,并實現了外源報告基因 GUS的有效表達[7]。結合前期工作基礎,本文進行了玻璃珠法與基因槍法、電擊法等不同方法的對比研究,在轉化效率、細胞損傷程度以及各方法優缺點等方面進行了比較,旨在確立一種最為適合鹽藻反應器的轉化方法。同時,對可能影響鹽藻玻璃珠轉化效率的若干因素進行了分析探討,為進一步提高轉化效率和盡早實現外源基因在鹽藻中的高效表達提供有力工具和借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鹽藻細胞及其培養條件

鹽藻藻株購自美國德州大學,培養基為 PKS液體培養基[8]。培養條件為:溫度 26℃;光暗比14∶10;光照強度為50 lx。實驗所用鹽藻細胞是固體培養基上挑取單藻落,接種 5 mL液體培養基培養10 d,然后擴大培養至細胞濃度 106個/m L備用。

1.1.2 轉化所用質粒

轉化所用表達質粒為pBI221-bar,由中國科學院遺傳研究所孫勇如教授惠贈。該質粒包含報告基因GUS和篩選標記BAR盒,用于篩選實驗和染色觀察,二者均由CaMV35S啟動子驅動,結構如圖1所示。

1.1.3 主要儀器及實驗耗材

圖1 質粒pBI221-bar結構示意圖

1.2 方法

鹽藻的轉化分別采用基因槍法[4]、電擊法[5]和玻璃珠法[7]3種方法進行,轉化后按照Jefferson法[9]對細胞進行固定染色,鏡檢觀察,計算轉化細胞數。在轉化實驗中,每實驗組設有 3組重復,實驗重復 3次。同時,實驗設有陰性對照組,即沒有加入質粒,其余操作過程均相同的處理組。

鹽藻在進行 3種不同方法轉化時,分別在轉化后的 12 h、24 h、36 h和 48 h計算空白組(即沒有加入質粒,又沒有進行轉化操作的對照組)與各個轉化組的細胞存活數目,比較不同轉化方法對細胞的損傷程度的最低。

此外,為獲得更加理想的轉化結果,對玻璃珠法的轉化過程操作、轉化過程中轉化試劑的選擇和注意事項、鹽藻的生長狀態和生長階段等關鍵環節進行了相關探討。

1.3 數據的統計學分析

無論在不同轉化方法轉化效率的比較實驗中,還是在轉化方法對鹽藻損傷程度分析性實驗中,其細胞的轉化數和細胞存活數均采用統計學分析軟件SPSS 11.0進行了 t檢驗處理,檢驗水準 P＜0.01,記錄結果。

2 結果

2.1 不同轉化方法對鹽藻的轉化結果

采用基因槍法、電擊法和玻璃珠法對鹽藻分別進行了轉化,均取得了陽性轉化結果。經組織化學染色后鏡檢觀察,未轉化的陰性對照組細胞呈淺黃色(見圖2a);而轉化的陽性細胞呈現藍色(見圖2b,箭頭所示),說明外源質粒已成功轉入鹽藻細胞,并且得到了有效表達。雖然 3種轉化方法均有陽性轉化細胞的獲得,但轉化細胞的數目差別很大。通過對每種轉化方法陽性轉化細胞的計數,轉化率以轉化細胞數/轉化總細胞數表示,玻璃珠法轉化率最高,能夠達到59%;基因槍法轉化率最低,僅有0.01%;電擊法轉化率居中,約為 2%。造成轉化率差異如此之大的主要原因與各種方法對細胞的損傷程度不一樣有關。為此,本研究接下來進行了 3種方法對細胞的損傷性分析。

圖2 GUS基因在鹽藻細胞表達后的組織化學染色(400×)

2.2 不同轉化方法對鹽藻細胞的損傷性分析

用 3種轉化方法分別對鹽藻進行轉化后,結果如圖3所示。從圖3可以看出:空白組沒有進行任何轉化處理操作,鹽藻數目隨著培養時間的延長,細胞數目在逐漸的增加。玻璃珠轉化組在轉化后的 12 h時,細胞數量變化不明顯,存活細胞數約為90%,在隨后培養的 36 h中,細胞數目變化也不明顯,呈現平穩趨勢。電擊轉化組在轉化后的 12 h時,細胞數量的減少明顯低于玻璃珠法轉化組,但高于基因槍轉化組,約有 58%的細胞存活?；驑屴D化組在轉化后的 12 h時,細胞數量明顯減少,下降幅度最大,存活細胞數僅占 26%。由此可見,玻璃珠法轉化后鹽藻細胞存活數最高,電擊法次之,基因槍法最低,這與三者方法的轉化率高低是相對應的,直接反映出 3種方法轉化率不同的原因所在。

圖3 不同轉化方法對鹽藻細胞存活數目的影響

2.3 影響鹽藻玻璃珠轉化法轉化效率的其他因素分析

玻璃珠轉化法原理是利用微小玻璃珠在旋轉體系中對宿主細胞的研磨作用,使得在細胞表面造成小而短暫的孔隙,以便外源基因進入細胞進而得以表達。在鹽藻的玻璃珠法轉化過程中,玻璃珠直徑大小、使用量和處理方法等方面的選擇對轉化結果都有著較大的影響。選擇直徑0.5mm左右的玻璃珠,取占轉化體積 30%左右的玻璃珠量對轉化較為有利[6]。轉化前玻璃珠的處理要科學規范,使用濃酸浸泡數小時后高溫烘干,達到潔凈玻璃珠表面,去除污物和油污的影響,進而增加玻璃珠的摩擦作用。在轉化過程中試劑的添加也較為重要,如聚乙二醇(PEG)的使用,PEG具有較強的聚合作用,在外源質粒經細胞表面的孔隙進入細胞內部后,能夠使其與細胞內部結構粘合,增加附著力,易于質粒與細胞基因組的整合。為此,在轉化中選擇合適類型的PEG以及PEG的濃度顯得十分重要。選擇聚合作用強、性能穩定的PEG產品較為有利,如PEG6000或PEG8000等。同時,PEG的使用濃度過低或過高都會造成轉化率下降[7]。

鹽藻細胞不同的生長階段對轉化率同樣有著較大的影響。鹽藻細胞的生長階段可分為生長緩慢期、生長快速期和生長穩定期 3個時期,呈典型的 S型生長曲線[10]。在生長緩慢期,鹽藻細胞生長緩慢,生命力不強,運動較活潑;而進入生長快速期時,細胞生長旺盛,運動活潑,細胞呈較大的橢圓形、綠色,生命力最強,容易吸收和容納外界物質(見圖4a);到生長穩定期時,細胞生長基本上處于停滯狀態,運動受限,細胞呈圓形,顏色淺黃(見圖4b)。為此,選擇處于生長快速期的細胞對獲得高轉化率有利。在實際研究工作中,大量的轉化實驗研究證實了該點結果。同時,在收集鹽藻細胞時,細胞的分層也要把握好。選擇懸浮于培養瓶中上層的細胞為好,該層細胞運動活潑,代謝旺盛,易于轉化工作。處于中下層的細胞,由于其聚集作用的產生,運行性較差,生長受限等原因,不宜選擇。

圖4 處于不同生長階段的鹽藻細胞形態(400×)

3 討論

鹽藻作為一種新型的生物反應器,當前受轉化環節的影響大大限制了鹽藻反應器的開發利用。為此,確立一種高效的轉化方法是當前亟待解決的關鍵環節。為克服當前存在的基因槍法和電擊法的不足之處,作者嘗試建立起了鹽藻的玻璃珠轉化法[7]。但該方法沒有與基因槍法、電擊法進行系統性比較分析。因此,本研究對此進行了比較研究。不僅對不同轉化方法的轉化效率進行了比較,而且在每種方法對細胞的損傷程度上也進行了比較。通過對 3種轉化方法轉化效率的比較,結果表明:玻璃珠法轉化效率最高,達到59%;而基因槍法和電擊法的轉化效率很低,分別僅有0.01%和2%。該 3種轉化方法轉化效率的高低在其他不同藻類研究中存在相似性[11]。而 3種轉化方法對細胞的損傷程度比較結果顯示:基因槍法的損傷程度最為嚴重,轉化后僅有 26%的細胞存活,其原因是由于受高壓氣體的直接沖擊,造成多數細胞的破碎,使得細胞存活數目急劇下降,這也是該方法轉化效率低下的重要原因所在。玻璃珠法對細胞的損傷程度最輕,轉化后約有 90%的細胞存活,這也是決定其高轉化效率的重要基礎。電擊法對細胞的損傷程度介于二者方法之間,約有 58%的細胞存活,也客觀反映了電擊法轉化效率高于基因槍法的原因。由此可見,轉化方法對細胞的損傷程度直接影響著轉化效率的高低。

此外,本文還進行了影響鹽藻玻璃珠法轉化結果的其他因素探討。在鹽藻玻璃珠轉化法整個操作過程的把握、轉化試劑的選擇和使用、鹽藻自身的狀態等方面都給出了注意事項和把握要點,力求最大程度上提高轉化效率。同時,在鹽藻的轉化過程中,盡可能減少不必要的操作步驟,盡可能的縮短對細胞的操作時間,對鹽藻的轉化也較為有利。

綜上所述,通過對鹽藻 3種不同轉化方法的比較,玻璃珠法不僅具有較佳的轉化效率、對宿主細胞的損傷作用小,而且還具有較高的經濟性、重復性和可控性好等優點,最為適合鹽藻細胞的遺傳轉化研究。同時,針對此 3種方法從不同方面又進行了各自優缺點的分析(見表1),希望為今后鹽藻的轉化工作提供參考。鹽藻玻璃珠轉化法的確立為加快鹽藻生物反應器的研究步伐,及早實現外源物質在該反應器中的表達起到了積極推動作用。

表1 鹽藻不同轉化方法優缺點的比較

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